赤芍水提物药物血清对HSC-T6细胞促凋亡作用实验研究.pdfVIP

赤芍水提物的药物血清对 HSC-T6 细胞促凋亡作用的实验研究 1韩海啸 1李军祥 2杨晋翔 2朱陵群 3刘大新 （1北京中医药大学东方医院 100078; 2 北京中医药大学东直门医院 100070 ； 3 北京大 学第一临床医院 100034 ） 摘要 目的 应用流式细胞法，研究灌服赤芍水提物后的犬血清对乙醛造模后的肝星状细 胞的促凋亡作用。方法 采用乙醛造模后的肝星状细胞株 HSC-T6 作为体外研究模型；以赤 芍水提物给彼格犬 1 次性灌胃，取给药前的血清、给药后 2 h 、3 h 血清作为实验药物血清。 以流式细胞法检测以上采血时间点上2 ％浓度的药物血清对乙醛造模后的HSC-T6 作用 72 h 后的促凋亡作用。结果 2 h 、3 h 两个时间点的含药血清能明显促进 HSC-T6 细胞的凋亡， 和同样条件下用空白血清培养的 HSC-T6 细胞相比其凋亡比例(apoptosis, APOP)显著性增加 （P0.05 ）。在药物血清的作用下两个时点组的 HSC-T6 细胞在 G0/G1 期细胞比例明显上升 （P 0.05 ）；而 S 期细胞显著减少（P 0.05 ）；但G2/M 期并没有一致性的变化。结论 两 个时点的药物血清对 HSC-T6 细胞都有显著的促凋亡作用，且能显著增加 HSC-T6 细胞在 G0/G1 期的比例及显著降低 S 期的比例，这可能是其抑制 HSC-T6 细胞增殖及促凋亡的原因 之一。 关键词 赤芍水提物；HSC-T6 ；流式细胞术；细胞培养 肝星状细胞是肝纤维化的主要效应细胞，其大量增殖和凋亡相对不足在肝纤维化的发 生中起核心作用，抑制其增殖和（或）诱导其凋亡是抗肝纤维化的重要对策。近年来研究表 明活血化瘀类药物赤芍对肝纤维化有很好的作用，显示出良好的开发与应用前景。在我们过 去的实验发现，灌服赤芍水提物后2 h 、 3 h提取的药物犬血清对HSC-T6 的增殖抑制作用最强。 根据以上结果，实验中我们采取这两个时间点犬的血清，观察此点药物血清对HSC-T6 的促 凋亡作用，为进一步研究赤芍入血后对肝星状细胞的凋亡机理提供理论依据。 1 材料 1.1 细胞系 肝星状细胞株HSC-T6 由北京友谊医院肝病中心馈赠。由SV40 转染 prague-Dauley大鼠星状细胞而成，其表型为活化的HSC ，能表达高水平的 Ⅰ型胶原、TIMP-1 mRNA等[1]。常规复苏、传代后，在5 ％ CO2 饱和条件下细胞培养箱内培养待用。 1.2 药品和主要试剂 赤芍水提物制备：赤芍水煮提取，提取液经50 %乙醇沉淀后，滤除沉 淀，上清液回收溶剂得赤芍水提物，1 mL水提物中含3 g生药，由北京中医药大学东方医院 药学部提供。主要试剂：DMEM ／高糖培养基：美国GIBCO公司提供；标准胎牛血清：国 356 产，天津川页公司提供；胰酶：GIBCO公司提供；乙醛：国产分析纯；6孔板细胞培养板： 丹麦NUNC 公司提供；染色液：碘化丙啶（propidium iodide,PI ）、RNA酶 ：SIGMA公司提 供。 1.3 仪器 CO2培养箱 :美国NAPCO5 410 型；倒置相差显微镜 : 日本OLYMPUS IM2型；DNA 周期及凋亡分析软件：Modit LT ；流式细胞分析仪器及软件。 2 方法 2.1 药物血清制备 用赤芍水提物给纯种雄性彼格犬1 次性灌胃，剂量为2 mL/kg （相当于 人体用量的10倍）。给药前空白狗血清、给药后2 h 、3 h各时点的血清(采用1只雄性彼格犬， 于灌胃后使用1次性真空抗凝管取血) ，灭活补体后于-20℃冰箱冷冻备用。 2.2 培养基的配制 基本培养基：DMEM培养基以三蒸水配制，加2.5 g/L 的NaHCO3 ， 2.2g/L 的Hepes 0.22 μm微孔滤膜过滤除菌，4 ℃下保存。完全培养基：90 ％基本培养基和10 ％标 准胎牛血清，