副猪嗜血杆菌单克隆抗体的制备和其B细胞抗原表位的初步鉴定.pdfVIP

后补论文 副猪嗜血杆菌单克隆抗体的制备及其B 细胞抗原表位的初步鉴定 1 1 1 2 1 3 1 1* 郑楠 ，符芳 ，柴政 ，姜福成 ，王香玲 ，张雪云 ，王卓 ，李曦 （1. 中国农业科学院哈尔滨兽医研究所兽医生物技术国家重点实验室，猪传染病研究室，黑龙江哈尔滨，150001；2. 黑龙江八一农垦大学，黑龙江大庆，163319；3. 哈尔滨师范大学，黑龙江哈尔滨，150080） 摘 要 为筛选具有临床诊断价值的副猪嗜血杆菌(H.parasuis)单克隆抗体(MAb)，本研究采用H.parasuis 5 型强毒株 （HPS-5 ）免疫BALB/c 小鼠，利用常规细胞融合技术制备了1 株稳定分泌MAb 的杂交瘤细胞株。Western blot 结果表 明该MAb 能够特异性识别所有H.parasuis 标准菌株；免疫沉淀技术与蛋白质谱分析显示该MAb 所识别蛋白为ATP 结 合盒转运蛋白（ABCT ）家族的寡肽透过酶（OppA）；利用MAb 对噬菌体12 肽库进行淘选，8 个阳性噬菌体克隆展示 有“KTPAE-R”保守序列，对应于H.parasuis SH29755 株和SH0165 株的469 位～475 位的氨基酸残基。对OppA 氨基 酸序列比对结果表明H.parasuis 与其它10 种猪常见细菌病病原序列一致性为9.1%～74.5%，本研究结果为进一步研究 H.parasuis 感染的病原学诊断建立了良好的基础。 关键词 副猪嗜血杆菌；ABCT ；OppA ；病原学诊断 副猪嗜血杆菌(H.parasuis) 属巴氏杆菌科嗜血杆菌属，NAD 依赖型、革兰氏阴性细小杆菌，能够 引起猪格拉泽氏病(Glassers disease)，通常可在健康猪的上呼吸道分离得到[1]。该病已经成为导致仔 猪死亡率高的一个重要原因，给世界养猪业造成严重的经济损失[2-4]。目前H.parasuis 的病原学诊断 方法包括细菌分离、免疫组化(IHC)技术、寡核普酸特异性捕获圆盘杂交(OSCPH)实验、PCR 等，但这 些方法都存在许多不足，如细菌的分离鉴定往往不能成功,用于 IHC 技术诊断的某些多克隆抗体与胸 膜肺炎放线杆菌（A. pleuropneumoniae ）有交叉反应，OSCPH 方法中与吲哚放线杆菌（A. indolicus ） 有交叉反应，基于16S rRNA 的测序引物在以A. indolicus DNA 作为模板时可以观察到一条弱带[5]。 H.parasuis 感染的血清学诊断包括补体结合试验(CF)和间接血凝试验(IHA) ，以及酶联免疫吸附试验(E LISA)等，但这些方法不一致并且不准确[5]，因此，研制特异性良好、遗传性状稳定和种间广谱的单 克隆抗体（MAb ）成为当务之急。 本研究利用H.parasuis 5 型强毒株(HPS-5)作为免疫原，成功制备质量优良的MAb 一株，为该病 的快速准确诊断提供了强有力的工具。 1 材料和方法 1.1 菌株、细胞与实验动物 15 个标准血清型的H.parasuis 菌株（HPS-1～HPS-15 ）、肠道沙门氏菌（S.enterica ）、金黄色葡萄 球菌（S.aureus ）、产肠毒素大肠杆菌(ETEC)、乳酸菌(LAB)、SP2/0 细胞、蓝耳病MAb 1G7 细胞株由 本实验室保存， BALB/c 小鼠购于中国农业科学院哈尔滨兽医研究所实验动物中心。 1.2 主要试剂 HAT 、HT 、弗氏完全佐剂(FCA)、弗氏不完全佐剂(FICA)均购自 Sigma 公司；二氨基联苯胺（D AB ）购自Tiangen 公司；MAb 亚型鉴定试剂盒购自SouthernBiotech 公司；噬菌体展示随机 12 肽库 购自 NEB 公司；Protein A/G PLUS-Agarose 购自Santa Cruz 公司；辣根过氧化物酶(HRP)标记的山 羊抗鼠 IgG 二抗购自北京中杉金桥公司；RIPA 裂解液( 中) 、苯甲基磺酰氟 (PMSF)均购自碧云天公 司。 1.3 动物免疫与细胞融合 将 100μg 的菌体蛋白与等体积的FCA 充分乳化免疫小鼠，每间隔2 周，将等量抗原与等体积FI CA 充分乳化进行第2 次、第3 次免