I型鸭病毒性肝炎病毒巢式RT-PCR检测方法建立与应用.pdfVIP

第五届中国畜牧科技论坛论文集 389 I型鸭病毒性肝炎病毒巢式RT—PCR检测方法的建立及应用 李娇1王文秀2沈志强L2’ 滨州256600) (1．山东绿都生物科技有限公司，山东滨州256600；2．山东省滨州畜牧兽医研究院，山东 建立了检测DHV—I的巢式RT-PCR检测方法。结果显示，该检测方法具有特异性强、敏感性高、 重复性好等优点，可以准确快速检测出极低含量的I型鸭病毒性肝炎病毒。解决了该病在组织病 料中检出困难的难题，为I型鸭病毒性肝炎的快速诊断、净化及深入研究奠定了基础。 关键词I型鸭病毒性肝炎病毒；巢式RT—PCR；检测 鸭病毒性肝炎(duckviral hepatitis，DVH)是 1材料和方法 由鸭病毒性肝炎病毒(duck virus，DHV) hepatitis 引起雏鸭的一种以肝脏为主要病理变化的急性、高 1．1病毒 度致死性、接触性传染性疾病【l】。该病主要侵害4 l型鸭病毒性肝炎病毒(DHV—I)、鸭病毒性肠 周龄内雏鸭，特别是不足l周龄的雏鸭最易感染， 炎病毒(DEV)、鸭细小病毒(DPV)、新城疫病毒 死亡率高达90％以上，是危害养鸭业最为严重的 传染病之一【2引。近年来，鸭病毒性肝炎在世界各 保存。 地不断发生，其发病率和死亡率均呈上升趋势，养 1．2主要试剂 鸭比较集中的地区均遭受了巨大的经济损失和严 In- 重的威胁，国内虽然已出现DHV—III，但DHV—I仍hibitor购自生工生物工程(上海)有限公司；Ex Taq 是目前流行的优势血清型。因此，加强DHV—I诊酶、pMDl8一T克隆载体及其它限制性内切酶均购 断技术的研究对预防和控制鸭病毒性肝炎具有重 自宝生物工程(大连)有限公司。 要的现实意义。目前，已有多种检测DHV—I抗原1．3引物的设计与合成 的方法，如病毒分离鉴定、中和试验、免疫电镜等， 根据已发表的DHV—I基因组序列，选择保守 这些方法虽然可以对病原做出诊断，但因其存在操 性比较强的5’非编码区域，利用Oli906．0生物学 作繁琐、费时、不能用于快速诊断、敏感性和特异性 软件设计合成了两对引物，由生工生物工程(上海) 差等缺点，在实际应用中受到很大限制。PCR作为 有限公司合成。引物序列如下： 5’CAT- 一种新的分子生物学检测技术，具有灵敏度高、快 第一轮扩增引物：上游引物：DHVFl 速、特异、操作简单、易标准化等优点，且可以检测 GTGTTCArTTGGCTAAGT3’ 病原体中特异性的核苷酸序列，具有常规诊断方法 下游引物：DHVR2 无可比拟的优势【4。5】。本研究选取I型DHV保守GT—ⅡTGT3’ 5’TCT- 性比较强的5’非编码区域，建立了DHV—I检测的 第二轮扩增引物：上游引物：DHVF3 逆转录巢式PCR方法，旨在为鸭病毒性肝炎的早 GTCCAGGCACATGCACAT3’ 期诊断、流行病学调查等提供一种有效的分子生物 下游引物：DHVR4 学检测方法。 CACAAGA3’ 基金项目：山东省自然科学基金(’2011BSAl6009) 作者简介：李娇，女，辽宁人，硕士研究生，主要