基因敲除策略在氨基酸产生菌代谢工程与应用.pdfVIP

201 全国生物化工技术发展研讨会论文与成果汇编 1济南 基因敲除策略在氨基酸产生菌代谢工程中的应用s 黄钦耿施巧琴吴松刚’ (福建麦丹生物集团有限公司．福州研究中心福州，福建350008) 摘要：基因敲除技术是一项重要的分子生物学技术，在氨基酸生产菌代谢工程中具有广 泛应用。从基因敲除技术的一般程序出发，主要介绍了氨基酸生产菌常用的基因敲除系 统，重点总结了基因敲除策略在微生物代谢工程中的应用，展望了代谢工程的发展前沿 和应用前景。 关键词：基因敲除，同源重组，代谢工程 生物体的自然生命代谢活动总的来说都是通过活细胞和细胞群的代谢网络来进行 的，这一代谢网络由一系列酶促反应以及特异性的膜转移系统构成。然而，细胞自身固 有的这种代谢网络对于我们的实际生产利用而言，其遗传特性通常并非最佳，这就需要 对基因信息进行尽可能多的解析，在理解细胞代谢功能的基础上，达到对细胞的代谢途 径与通路进行有目的的修饰与调控的目的。 随着越来越多的微生物的基因组序列全测序，微生物代谢机理认识的不断加深，伴 随着生物化学、细胞生物学、应用分子生物学、遗传工程的发展，定向操纵遗传变化成 代谢工程的文章，也首次提出代谢工程这个词，同时将代谢工程定义为应用DNA重组技 术对细胞的酶、转运及调控功能进行修饰，从而实现更高效的生物化学转化、能量转移 及大分子装配过程，改善细胞功能的技术。实质就是对已知代谢途径和代谢调控进行定 量分析，在此基础上利用分子生物学和遗传学手段对其代谢进行有目的改造，从而获得 目的突变菌株。 近年来由于基因组学、应用分子生物学与分析技术的发展，越来越多的研究方法和 策略被应用于代谢工程的研究，基因敲除技术便是其中重要的一种。基因敲除是20世纪 80年代发展起来的一项重要的分子生物学技术。是通过同源重组将外源基因定点整合入 靶细胞基因组上某一确定的位点，以达到定点修饰改造染色体上某一基因的一种技术。 利用微生物体内的同源重组系统，在一定选择压力下使体外改造的某功能基因与受体细 胞染色体上的功能基因之间发生同源重组，从而改变细胞的遗传特性。它克服了随机整 合的盲目性和偶然性，是一种理想的修饰、改造生物遗传物质的方法。这项技术的诞生 可以说是分子生物学技术上继转基因技术后的又一革命。尤其是条件性、诱导性基因打 8基金资助：国家发改委“2010年国家高技术产业化微生物制造专项”。 ·通讯作者：吴松刚，教授；E-mail：wsgS0142420yahoo．com．CD 116 全国生物化工技术发展研讨会论文与成果汇编 2011济南 靶系统的建立，使得对基因靶位时问和空间上的操作更加明确、效果更加精确、可靠， 它的发展为现代氨基酸生产菌株的代谢工程改造提供了一个全新的、强有力的研究策 略。 1基因敲除技术的原理及一般程序 基因敲除是通过一定的途径使机体特定的基因缺失或失活的技术。通常意义上的基 因敲除主要的原理是基因的同源重组机制，是指用外源的基因片段与受体细胞的基因组 中序列相同或相近的基因发生同源重组，从而替代靶基因片段，达到目的基因失活或缺 失的目的。这种技术的优点在于能够对特定位点的基因序列进行精准操作。在微生物方 面的研究主要集中于基因功能和基因工程育种的研究方面。虽然各种敲除的系统有不 同，但基因相同的原理，基因敲除也有着一般的相同程序，主要包括： (1)PCR引物 的设计。根据所需要敲除的目标基因的侧翼序列或起止序列以及特异性的筛选标记(如 氯霉素抗性标记等)序列设计特异性的敲除组件的扩增引物(可根据敲除体系的需要设 计侧翼同源序列的长度，也可设计侧翼序列的上下游序列获得长同源序列的敲除组件)， 同时为方便后期的筛选需设计多对的中问验证引物。 (2)敲除组件的PCR扩增及敲除 载体的构建。采用两轮次的PCR进行侧翼同源序列及重叠序列和筛选标记序列等敲除组 件的线性扩增：拟或利用重叠的序列粘端构建环状质粒载体实现目标基因重组交换。(3) 敲除组件导入受体细胞。在微生物系统中，一般采用电穿孔的方式将线性敲除组件或坏 状的敲除载