猪布鲁氏菌otpR与cpk基因缺失菌株的构建.pdfVIP

猪的传染病一猪细菌病 物具有一定保护性的实验结果为以该蛋白为基础研制广谱抗多个血清型菌株的基因工程疫苗奠定了 基础，可进一步通过添加佐剂，改变免疫途径，增加免疫剂量等方式提高其保护效果。 此外，在本实验中，对小鼠和豚鼠腹腔接种高剂量的HPS等可能引起动物体内内毒素水平增高， 对于实验造成一定的阻碍作用。综合作者实验结果及国内外以小鼠和豚鼠甚至是猪为动物模型研究 HPS的报告等【23’州，即使是强毒力株HPS也需要接种较高剂量才能使易感动物致死。在临床上，存在 着HPS与多种病毒细菌混合感染的情况，尤其是病毒性疾病如仔猪断奶多系统衰竭综合症、猪繁殖 与呼吸综合症等的流行造成猪群免疫力下降为HPS致病提供了可乘之机¨引，因此在建立HPS动物模 型以研究免疫保护等实验时，可以考虑让清洁级健康动物感染此类病毒再进行HPS接种以使感染和 致死剂量降低，或者是通过在免疫动物攻毒之前免疫内毒素等方式以排除内毒素对于实验造成的于 扰。 ◆考文献(略) 猪布鲁氏菌otpR和cpk基因缺失菌株的构建 刘文娟牛建蕊王真刘文晓吴清民 (中国农业大学动物医学院，农业部人畜共患病重点开放实验室，动物布病防控研究室，北京100193) 布鲁氏菌病是由布鲁氏菌引起的人畜共患的慢性传染病，病原体缺乏经典的毒力因子，如外毒 素、荚膜、菌毛、鞭毛、胞外酶和溶细胞素等，因此布鲁氏菌毒力评价指标主要是通过细胞内或体 内增殖能力和存活能力判定的。截止目前为止，人们已公认的毒力相关因子有布鲁氏菌Ⅳ型分泌系 统、胞罐脂多糖LPS、环p一1、2．多聚糖以及曰，r．跏iv腺二元调控系统等¨曲√’。 近年来，随着分子细菌学和分子遗传学的发展，对布鲁氏菌致病机理以及适应机体内外环境变 化的调控系统研究正在逐渐展开。现有研究表明，细菌主要通过内部的二元调控系统来保持对外界 环境的适应。该系统广泛存在于各类细菌中，不仅参与了细菌的基本生命活动，还与多种病原菌的 毒力和致病性密切相关。通过基因组序列分析和比较发现，在布鲁氏菌基因组中具有19个具备组氨 酸蛋白激酶的感受蛋白和21个具有反应性的调控蛋白，大约组成10．12组二元调控系统。目前已经 有五组系统已被研究‘6^8’9’1m。 两个同源基因，即otpR和cpk，处于一个操纵子内部。早期我们通过转座子插入羊布鲁氏菌16M破 坏了otpR基冈所在的操纵子，发现突变株在小鼠体内毒力降低，并且对酸性、渗透压和温度等环境 的刺激敏感，但该操纵子在两种细菌基因组中排列次序和氨基酸同源性不同，在猪布鲁氏菌中是否 具有相同功能以及与下游基因间的相互作用如何等问题有待研究。本实验在我们前期研究工作的基 础上，构建了猪布鲁氏菌otpR和cpk基因缺失株，为进一步研究该两个基因的生物学功能奠定基础。 1材料和方法 1．1材料 1．1．1菌株、质粒和培养基 猪布鲁氏菌1330、pKD4由本实验室保存；DH5a和DHloB购自全式金公司：pBluescriptsIIKS(+) 1998，212：77—86)。 购自InVi怕gen公司；质粒pEXl8AP(参见TungT．Ho柚g，Gene 1．1．2引物列表 表l用于构建同源重组质粒扩增不同片段的PCR引物序列 引物 序列(5’～3’) 含自．的酶切位点 片段 !蔓婴曼! 兰呈g望!堕竺皇f兰：二圣：2 墨曼!生：呈望兰Y婴曼!i塑! 里璺鎏坐曼坠! WU45lF CGGGATCCTAAlfrAGGGTCGCCGGGTGC肋mHI ．otpR上游 wU452RGAATTCGCCTGTCCrCGTrAarC”广r＆oR I otpR上游 兰旦兰i：￡垒望g兰g垒垒里垒!璺Q￡Qg垒g垒兰g垒兰垒垒：垒兰翌垦!：Q12墨工鲎 862 第十三次学术研讨会会议论文集 1．1．3工具酶和试剂 限制性内切酶购自Fe册entas公司；T4DNA连接酶购自NEB公司；Taq酶购自北京美莱博医