罗勒植物ISSR-PCR反应体系的建立和优化.pdfVIP

第九届全国药用植物及植物药学术研讨会 罗勒植物ISSR-一PCR反应体系的建立与优化 赵鑫1，凯撒苏来曼p，朱国强2，阿伊另IJ克2 (1．沈阳农业大学，辽宁沈阳110161；2．新疆中药民族药研究所，新疆乌鲁木齐830002) 摘要：目的建立罗勒ISSR分析的PCR反应体系。方法CTAB法提取叶片DNA。通 DNA聚合酶用量、dNTP、引物和M92+浓度4种因素对 过单因素试验，研究了Taq ISSR--PCR扩增的影响，建立了适合于罗勒ISSR--PCR反应体系。结果适于罗勒 ISSR--PCI扳应体系为25ui总体积中内含IxPCR反应缓冲液(Mgflee)、1．5UTaqDNA ISSR--PCR反应体系，为应用ISSR技术鉴定罗勒种质资源和遗传多样性研究奠定了 基础。 关键词：罗勒：ISSR-PCR basilicum 罗勒(Ocimum Linn．)唇形科 采用改良的CTAB微量法提取基因组总 罗勒属植物，是我国传统中药之一，《中药大 DNA[11，用0．8％的琼脂糖电泳检测DNA质 典》谓其有疏风解表、化湿和中、行气活血、 量，DNA的纯度和浓度用紫外分光光度计法 强心安神、解肿等功效。近年来ISSR己广 测定，并将DNA浓度稀释到20ng／vL，于 泛应用于品种鉴定、种质资源和遗传多样性 ．20C保存备用【2】。 研究等领域。本研究采用单因素试验法，对 体系中的各因素进行筛选，建立了罗勒植物 1．3．2 PCR扩增与体系优化设计 的ISSR反应体系，为研究罗勒的遗传多样性 在罗勒ISSR分析体系的初步建立中， 奠定基础。 x PCR反应体积为25ul，内含lPCR反应缓 1材料与方法 冲液、2．Ommol／L mmol／LdNTP、 MgCl2、0．2 1．1材料 0．3 U vlno儿引物、1．0 TapDNA聚合酶 (TaKaRa)与50 将罗勒种子播于穴盘萌发幼苗，待幼苗 ng总DNA。扩增程序为94‘C 长出两片真叶时取样，液氮冷冻后于-80℃保 3min，94℃45S，54℃1min．72℃2min， 存，待用。罗勒种子由新疆中药民族药研究 35次循环，72℃7mm。从引物浓度、dNTP 所凯撒苏来曼研究员提供。 浓度、Mg浓度和DNA聚合酶浓度等方面对 罗勒ISSR分析体系进行优化。各因素水平见 1．2试剂 表l。 实验所用TaqDNA聚合酶、dNTP、 表1影响ISSR的各因素配比 DNAmarker(DL2000)均购自TaKaRa(宝)生物 工程(大连)有限公司。ISSR引物采用加拿 反应成分