地中海拟无枝酸菌S699电转化方法的优化.pdfVIP

第 53卷第 4期 湖 北 农 业 科 学 Vo1．53No．4 2014年 2月 HubeiAgriculturalSciences Feb．．2014 地中海拟无枝酸菌$699电转化方法的优化 王明艳 ．何 绿 (华中农业大学农业微生物学国家重点实验室 ，武汉 430070) 摘要 ：地 中海拟无枝酸菌$699 (AmycolatopsismeditetTanei$699)能够产生具有重要经济价值 的抗生 素——利福霉素 B 在该菌株 中建立高效的遗传操作系统是研究利福霉素生物合成机制 以及构建基 因工 程高产菌株 的基础。研 究利用单因素试验探索了供体质粒的构型 、甘氨酸溶度 、MgC1，浓度及 电转化参数 对地 中海拟无枝酸菌 $699电转化效率的影响 。结果表 明，使 用添加 了0．O5g／L甘氨酸和 2．5mmol／L MgC1，的34％YEME培养基培养菌丝体 ，在 9kV／cm、25txF、550Q 的电转化条件下，以双链 DNA为供 体 ，转化效率最高可达到3．37x102个转化子／gDNA。利用优化后 的电转化方法，成功地获得 了利福霉素 生物合成基 因簇 中细胞色素P450氧化酶基 因。 的同源缺失突变菌株 ，证实 了优化后的 电转化方法可 以很好地用于后期遗传学及利福霉素生物合成基 因的研究 关键词：地中海拟无枝酸菌 $699(Amycolatopssimediterranei$699)；利福霉素B；电转化；同源缺失 中图分类号：Q784 文献标识码 ：A 文章编号：0439—8114(2014)04—0920—05 Optim izing ElectrOporatiOn ofAmycolatopsismediterranei$699 WANG Ming—yan，HE Jing (StateKeyLaboratoryofAgriculturalMicrobiology，HuazhongA culturalUniversity，Wuhan430070，China) Abstract：Amycolatopsismediterranei$699 produced an important antibiotic，rifamycin B having high economic value．To investigatebiosyntheticpathwayofrifamycinsand constructhigh-yield strainsby genetic engineering，establishmentofahigh— lyefficientgeneticmanipulation system wascritically required in thisstrain．The effectsofdsDNA and ssDNA ，concentration ofglycine and MgC12in culture medium ，and electroporation parameterson electroporation efficiency were studied by single factortest．Using 34％ YEME medium supplementedwith 0．05g／L glycineand 2．5 mmol／L MgC12to cultivate mycelia，elec— troporation parameterso