质粒DNA的提取纯化与鉴定.ppt

质粒DNA的提取纯化与鉴定 一、基因克隆的质粒载体 1、定义 双链闭环DNA； 1kb--200kb； 独立存在于宿主染色体之外； 具复制起始点； 复制和转录不同程度依赖于宿主基因； 编码某些酶，使宿主具有特殊标志， 可供选择。 2、载体性质 （1）.复制能力； （2）.容纳外源DNA的能力； （3）.选择标记：抗生素耐受。 （4）.引入多克隆位点； （5）.引入重组选择标记。 3、载体分类： 按功能分 1.克隆载体 2.表达载体 按宿主性质 1.原核载体:质粒载体、粘粒、噬 菌粒、 λ噬菌体、噬菌体M13等 2.真核载体:逆转录病毒、腺病毒、 昆虫杆状病毒 3.穿梭载体 4、常用质粒载体 例如：1. pBR322、pUC 18/19、 pUC118/119、pGEM、 pBluescript、 pBluescript SK/KS等 2. pET、pGEMEX、pGEX等 3. pALTER等 5、常用质粒宿主： HB101、DH5α、TG1、JM系列等 BL21（DE3）等 二、质粒DNA的分离纯化 试剂的参考配方: Solution I：50mmo1／L 葡萄糖、5mmo1／L 三羟甲基氨基甲烷(Tris)Tris?HCl(pH8.0)、1.0 mmo1／L 乙二胺四乙酸(EDTA)(pH8.0) Solution II：0.4mo1／L Na0H，2％SDS(十二烷基硫酸钠)，用前等体积混合 Solution III：5mo1／L 醋酸钾 60 mL、冰乙酸 11.5mL、水 28.5mL TE缓冲液：10mmo1／L Tris?HCl、1mmo1／L EDTA(pH8.0) （一）、细菌培养物的生长和收获 将3mL含Amp的LB液体培养基加入到两支试管中，接入含重组质粒的大肠杆菌，37℃振荡培养过夜。 （二）、质粒DNA的提取 1．将过夜培养的2-4m1细菌，12,000rpm高速离心1分钟，彻底去除上清。(菌液较多时可以多次离心收集菌体)2．加入200 ? l solution I，用枪头或振荡器充分悬浮细菌。（注：Solution I内含RNaseA，每次实验结束后，4℃保存。）3．加入250 ? l Solution II，立即轻柔上下颠倒离心管5-10次，使细菌裂解，室温放置(2-5分钟左右)至溶液变成澄清。（注：温度低时，Soluion II有白色沉淀析出，37度以下保温溶解，摇匀后使用。） 4．加入350 ? l Solution III，立即轻柔上下颠倒5-10次至出现大量白色絮状沉淀，使之充分中和，室温放置2分钟。5．12,000rpm高速离心15分钟。 6．取出2ml样品收集管和吸附柱，在管壁标上样品号，将步骤5中的上清小心吸取全部转移到吸附柱里。12,000rpm离心1分钟。7．取下吸附柱，弃去掉收集管中的废液，将吸附柱放入同一支收集管中，吸取700 ? l Wash Solution到吸附柱，离心1分钟。8．重复步骤7一次。9．取下吸附柱，弃去掉收集管中的废液，将柱放入同—支收集管中，12,000rpm高速离心2分钟。10．将吸附柱放入干净的1．5m1的离心管中，在柱子膜中央加30-50 ? l TE或灭菌纯水，不要盖上离心管盖，室温下放置2分钟；盖上离心管盖，室温12,000rpm高速离心1分钟。 注意：将TE或水预热到50℃左右可以提高洗脱效率。 11．取1-2? l洗脱液做浓度测定，1%琼脂糖凝胶电泳或酶切分析。 三、质粒DNA的鉴定 （一）、紫外光谱分析 通常使用样品的吸光度鉴定其浓度和纯度。 （二）、EB荧光分析 （三）、电泳鉴定 在凝胶电泳中，DNA分子的迁移速度与分子量的对数值成反比关系。质粒DNA经单一酶切后与DNA Marker进行电泳对照，即可知该质粒的分子量大小。 质粒的电泳图谱 质粒DNA的鉴定和酶切分析 一、质粒的琼脂糖凝胶电泳鉴定 二、质粒的限制性内切酶消化鉴定 实验原理 DNA分子在高于等电点的pH 溶液中带负电荷，在电场中向正极移动。由于糖—磷酸骨架在结构上的重复性质，相同数量碱基的双链DNA几乎具有等量的净电荷，因此它们能以同样的速度向正极方向移动。 在一定的电场强度下，DNA分子的迁移速度取决于分子本身的大小和