利用体内诱导抗原技术检测胸膜肺炎放杆菌体内表达基因.pdfVIP

第三届猪病防控学术研讨会会议论文集 本研究通过对胸膜肺炎放线杆菌apxIV基因进行恒温扩增，成功地扩增出l～11型这11个血清 PCR扩增相比较，证明LAMP方法比NestedPCR 型的胸膜肺炎放线杆菌的apxlV基因，并与Nested 具有更高的灵敏度。并且LAMP法具有操作简单、快速、特异性强等特点，在临床上检测APP具有 非常广泛的应用前景。 研究中尚存在有待进一步解决的问题，比如LAMP扩增体系的最适缓冲体系的确定，方法的临 床检出率等。 参考文献(略) 刘慧芳，刘思国·，王春来，司微，王聃，杜艳芬，赫明雷，常月红 (中国农业科学院哈尔滨兽医研究所兽医生物技术国家重点实验室／动物细茵病研究室，黑龙江哈尔滨150001) 摘要本研究利用体内诱导抗原技术(IVIAT)对胸膜肺炎放线杆菌体内表达的基因进行了研究．．首先将我们收集 到的5份感染了APPl的猪血清混合，分另q吸附体外培养的APPl和大肠杆菌DE3的全茵及全茵的裂解物，以充分 落原位免疫杂交来筛选该基因组表达文库，筛选了3000个茵落初步获得16个阳性克隆，通过再次筛选最后确定获 得12个阳性克隆．本研究为抗病原菌药物、疫苗乃至新的诊断试剂的开发提供依据． 关键词胸膜肺炎放线杆菌．体内诱导抗原技术，菌落原位免疫杂交 猪传染性胸膜肺炎是由胸膜肺炎放线杆菌(Actinobacillus 以出血性、纤维素性和坏死性肺炎为特征的高度传染性呼吸道疾病，给世界养猪业造成严重的经济 损失。尽管灭活疫苗一直被用来预防和控制该病，但是，由于胸膜肺炎放线杆菌有15种血清型，血 清型多，而灭活疫苗对各血清型之间又没有较好的交叉保护，因此研制新型疫苗势在必行。 目前，对胸膜肺炎放线杆菌毒力因子的具体数量和其分子致病机理还远不明了，而这正是新型 vivo 疫苗研发滞后的症结所在。病原微生物感染宿主时被诱导表达的基因称为体内诱导基因(in 测病原微生物体内表达基因的方法，包括体内表达技术(伽vivo-expression fluorescence 标记突变技术(signature-taggedmutagenesis，STM)、差异荧光诱导(differentialinduction, DFI)和体内诱导抗原技术(／nvivoinduced antigen 成功地筛选了肠炎沙门氏菌的35个阳性克隆。胸膜肺炎放线杆菌体内诱导抗原的发现将对胸膜肺炎 放线杆菌分子致病机制研究和新型疫苗的开发具有重要意义。 本研究的目的旨在通过IVIAT技术寻找胸膜肺炎放线杆菌体内诱导抗原，为新的保护性抗原乃至 胸膜肺炎放线杆菌新的疫苗开发奠定基础。 l材料和方法 1．1菌株和质粒 pET30a-c均由本实验室保存。 1．2主要试剂 Kit Ligation 675 圈 生物工程有限公司。 1．3 APP血清1型薯染猪血清的暇附 App rm清l型自然感染猪血清(5份．等体积混合)由本实验室获得并保存。血清的处理方法参 照文献。先将血清与APPI和大肠杆菌DE3全菌吸附；再与两菌全菌超声裂解物吸附；最后与两苗全 苗热变性的裂解物吸附。吸附完的血清分别进行APPI全苗裂解物和大肠杆菌DE3全菌裂解物包被 ELISA的检测，将检测完的血清分装保存到-80C冰箱，以备下一步使用。 1．4囊鹿肺觉放饯杆■基因组寰达文库的构建与鉴定 表达文库的构建参照文献进行。基因组DNA用限制性内切LR*p1431酶切确定最佳的酶切时间，小量 胶回收试剂盒回收05-2．0kb的片段．并与经限制性内切酶Ba