黄芩苷对鱼藤酮致PC12细胞损伤的保护作用研究.docVIP

黄芩苷对鱼藤酮致PC12细胞损伤的保护作用研究 　　[摘要] 目的：探讨黄芩苷对鱼藤酮致PC12细胞损伤的保护作用及其机制。方法：建立鱼藤酮损伤PC12细胞模型，采用终浓度分别为0.1，1，10 μmol?L-1的黄芩苷进行药物干预；四氮唑盐（MTT）法检测细胞活力，并用显微镜观察细胞形态；应用Annexin V-FITC/PI双染流式细胞术检测细胞凋亡；采用荧光探针二氯荧光素-双乙酸盐（DCF-DA）测定细胞内氧自由基（ROS）；采用蛋白免疫印记法检测凋亡信号蛋白Bcl-2，Bax及Caspase-3表达。结果：PC12细胞经1.5 μmol?L-1鱼藤酮孵育24 h后细胞活力显著降低，黄芩苷对鱼藤酮所致的细胞损伤呈现剂量依赖性的保护作用；流式细胞术分析表明黄芩苷可明显减少鱼藤酮致PC12细胞凋亡比例；荧光显微镜观察发现黄芩苷能明显减少鱼藤酮损伤PC12细胞ROS含量，免疫印迹实验表明黄芩苷可上调模型细胞Bcl-2及下调Bax表达并减少活化Caspase-3含量。结论：黄芩苷对鱼藤酮诱导的PC12损伤具有保护作用活性，其机制可能与黄芩苷减少鱼藤酮诱导PC12细胞ROS含量，抑制线粒体凋亡通路有关。 　　[关键词] PC12细胞；帕金森病；鱼藤酮；黄芩苷 　　[收稿日期] 2013-12-09 　　[基金项目] 国家自然科学基金项目；山西省中医药研究院院级课题（201101）；山西省国际合作项目（2011081068） 　　[通信作者] 冯玛莉，主任医师，硕士生导师，E-mail：fengmali1@163.com 　　[作者简介] 吉海杰，博士，副主任药师，E-mail：jihaijie82@ 　　帕金森病是老年人常见的神经系统退行性疾病，临床症状主要表现为静止性震颤、运动迟缓、肌肉僵直及姿势平衡障碍等。据2005年的一项流行病学调查估计我国帕金森病患者已达170万[1]，随着人口老龄化程度的加剧，对帕金森病的预防和治疗研究显得十分迫切。鱼藤酮是一种植物来源的杀虫剂，其通过不可逆结合线粒体电子传递链的NADPH脱氢酶使之失活，导致细胞对氧的利用障碍和能量产生不足，动物研究表明鱼藤酮可以导致黑质多巴胺能神经元变性，诱发帕金森样症状[2]。大鼠肾上腺嗜铬细胞瘤细胞（PC12）具有神经分泌细胞和神经元的性质，广泛应用于神经毒理、神经生化等方面的研究[3]，由于与中脑多巴胺能神经元接近，现已成为国内外研究帕金森病的常用细胞模型。 　　黄芩为唇形科植物黄芩的干燥根，始载于《神农本草经》，具有清热解毒、燥湿泻火、止血安胎之功效。黄芩苷是中药黄芩的主要有效成分，药典规定黄芩含黄芩苷不得少于9.0%[4]。黄芩苷具有广泛的神经药理活性，体内研究显示对大鼠大脑中动脉永久结扎造成的脑缺血损伤具有保护作用[5]，对MPTP诱导帕金森病模型小鼠具有预防保护作用[6]，体外研究显示对Aβ诱导SH-SY5Y细胞损伤具有保护作用[7]，对鱼藤酮诱导的大鼠皮质层神经元损伤具有保护作用[8]。本研究采用鱼藤酮诱导PC12细胞损伤模型来观察黄芩苷的神经保护作用，并对及其作用机制进行初步探讨。 　　1 材料和方法 　　1.1 药物与试剂 黄芩苷购自中国食品药品检定研究院，二甲基亚砜溶解配制成0.1 mol?L-1的储备液，实验时用培养基稀释至相应浓度。鱼藤酮、噻唑蓝（MTT）购于Sigma公司；Annexin V-FITC/PI试剂盒及活性氧（ROS）检测试剂盒购于碧云天生物技术有限公司；DMEM培养基、马血清及胎牛血清均购自美国Invitrogen公司；β-actin，Bax，Bcl-2和Caspase-3多克隆抗体为Santa Cruz公司产品；神经节苷酯GM1，批号5010011EN，齐鲁制药有限公司生产；其余试剂为国产分析纯。 　　1.2 细胞株 PC12细胞由中国医学科学院基础所细胞中心提供，培养于含5%胎牛血清和5%马血清的DMEM培养基中，常规传代培养。 　　1.3 仪器 倒置显微镜（Nikon，日本）；流式细胞仪（BD，美国）；凝胶成像仪（Fuji，日本）。 　　1.4 细胞模型建立及药物处理 待PC12细胞在培养瓶中培养至铺满单层后，轻轻吹打形成单细胞悬液，倒置显微镜下计数，用培养液调整细胞密度为5×107个/L。将细胞接种在96孔板中，每孔100 μL，放置细胞培养箱孵育24 h，待细胞完全贴壁后加入含不同浓度鱼藤酮培养基，终浓度在0.5～4.0 μmol?L-1，共设5个浓度组。对照组加入DMEM完全培养基。37 ℃，5%CO2条件下培养24 h后MTT法测定细胞活力。选择使细胞活力降低为正常值的60%～80%鱼藤酮浓度为后续实验的造模条件。实验分为5组：正常对照组、鱼藤酮模型组、黄芩苷低、中、