尘螨过敏性哮喘小鼠模型的建立与评估.pdfVIP

2008年全国儿科热点研讨会论文集 尘螨过敏性哮喘小鼠模型的建2-7评估 郭伟1．李孟荣2。肖建军1．黄敏1 (1．天津市儿童医院呼吸科，天津；2．温州医学院附属育英儿童医院) 本文参考国外文献，用尘螨抗原一Derp致敏激发建立动物哮喘模型，观测气道反应性，肺组织病理改变等 指标。 1材料与方法 1．1动物和试剂 清洁级C57B肌J雌性小鼠12只，6—8周，体重18—22g，购自上海必凯实验动物有限责任公司。饲养 1．2模型的建立 正常组用生理盐水，模型组用尘螨抗厉驴氢氧化铝(20 0#2 始激发，隔日一次，共7次。模型组小鼠麻醉后用尘螨抗原50斗L滴鼻(i．n．)激发，浓度为4mg／mL，正常组 用生理盐水代替。 1．3气道高反应性检测 采用Med．1abU(南京美易科技有限公司提供)生物信号采集分析系统，首先对系统进行定标，定标过程 是确定系统输出与输入的对应关系。对应关系包括零点和变化比例。零点调整是把输人为零时的输出值设 置为零。实验过程中，根据定标过程确定的零点和变化率，可以精确地计算输入端的实际数值。小鼠末次激 发后24小时，腹腔注射25％乌拉坦麻醉，5mL／kg，行气管插管并固定，分离一侧颈外静脉行静脉插管并固 定，另外在小鼠右前胸4～5肋间行胸膜腔插管。然后，将小鼠放人体积描记器里。主要记录指标：潮气量 (Ⅵ’)，跨肺压(Ptp)，气道流速(t)，记录基础值，然后将不同浓度的MCh(0．5，1，2，4，8oe／mL)，0．5ml_／kg， 通过静脉给药，观察潮气量、跨肺压和气道流速的变化情况。并比较气道阻力(Raw)和肺动态顺应性 (Cdyn)的变化，Raw是气流通过呼吸道时在吸气、呼气过程中肺处于等容量下，其等于推动压力与流速之比 ’ 1．4 BALF中细胞计数 mL 将BALF的沉渣用1PBS液重悬，用细胞计数板计数细胞总数，少量的红细胞不计人总数，取 O．02mL PBS重悬液用嗜酸细胞计数液做EOS绝对值计数，所有细胞计数工作均由一专人完成。 1．5光镜标本制作及观察 石蜡包埋后的左肺组织，切片，4Ixm厚，常规苏木精一伊红染色，观察支气管及血管周围的炎症细胞浸 润情况，有无水肿，上皮损伤等情况，并予以评分。AB-PAS染色，观察杯状细胞增生及黏液分泌情况，红 色表示中性黏液，蓝色表示酸性黏液，紫红色表示中性和酸性的混合物。甲苯胺蓝染色观察肥大细胞及 其颗粒。 1．6电镜标本的制作及观察 mm×1ntln×l 快速取近左肺门组织约l mill大小，用冷的2．5％戊二醛作前固定，再用l％的锇酸后固 构的改变，是否出现板层体空泡化和排空现象，EOS和中性粒细胞等炎症细胞的浸润，肥大细胞及杯状细胞 的改变，纤毛结构的变化，肺泡隔增厚和基底膜增厚。 -71· 2008年全国儿科热点研讨会论文集 2结果 2．1气道反应性 ①小鼠Raw的检测：静脉注射不同浓度MCh后，小鼠的Raw逐渐增大，模型组增大的幅度显著高于正常组 于正常组(P0．05或P0．01)。 2．2 BALF中细胞总数和EOS绝对值计数的比较 (PO．01)。 2．3肺组织病理改变 正常组小鼠肺组织结构完整，各级支气管腔规则，黏膜上皮完整无脱落，支气管及血管周围未见炎症细 胞浸润，细支气管平滑肌未出现增殖等情况。无明显的杯状细胞未见黏液栓，未见明显的肥大细胞颗粒。 模型组小鼠肺组织大体观察：肉眼可见哮喘组小鼠肺脏呈轻度均匀性膨大，色发自、浑浊，有多处不规则 的暗红色充血区，切面有白色粘稠的分泌物渗出。镜下观察：肺组织切片苏木精一伊红染色可见支气管及血 管周围炎性细胞浸润，以EOS、淋巴细胞和中性粒细胞为主，肺间质及肺泡腔内也可见炎性细胞浸润，气道上 皮多处断裂或脱落，纤毛细胞消失、上皮纤毛改变，亦可见黏液细胞，基底膜轻度增厚且形态不规则，细支气 管平滑肌轻度肥大，支气管管壁轻度增厚。杯状细胞增多，大量黏液分泌，肺组织内可见大量的肥大细胞颗 粒。 2．4小鼠支气管及肺细小动脉超微结构