瘦素受体基因Lys109Arg+多态性与非酒精性脂肪性肝病的关系.pdfVIP

瘦素受体基因Lys109Arg 多态性与非酒精性脂肪性肝病的关系 陈韶华 厉有名 姜玲玲 虞朝辉 浙江大学医学院附属第一医院消化科（310003） 近年来，非酒精性脂肪性肝病（non-alcoholic fatty liver disease,NAFLD ）的发病率逐年升高，已 引起广大医务工作者极大的关注，其发病机制也得到日益深入的研究。有研究证实瘦素受体参与 NAFLD 的发生和发展，本研究通过寡核苷酸芯片法检测 NAFLD 患者与正常人群瘦素受体 Lys109Arg 基因多态性（AAG-AGG 变异），分析其与NAFLD 发病的关系。 对象与方法 一、研究对象 收集浙江大学医学院附属第一医院接受体检180例成年人，分成2组：（1）NAFLD组117例，男 77例，女40例，年龄50.42±13.05岁；NAFLD 的诊断标准根据2002年中华医学会肝脏病学分会脂肪肝 和酒精性肝病学组制定的非酒精性脂肪性肝病诊断标准。（2 ）对照组63例，男32例，女31例，年龄 49.13±14.52岁。所有入选对象均签署知情同意书。 二、临床资料 检测身高、体重、臀围、腰围、体脂、腹壁脂肪厚度和血压；并计算体重指数（BMI ）＝身高/ 2 2 体重 （kg/m ）和腰臀比＝腰围/臀围。血标本用于检测甘油三酯、总胆固醇、高密度脂蛋白和血糖 水平。采用TANITA仪（TBF-300GS, TANITA Corporation of America,Inc ）测定体脂含量（BF% ）； 腹壁脂肪厚度测量方法是嘱受试对象排空膀胱，平卧位，下肢屈曲，腹壁松弛，在脐下1cm处用左 手拇指和食指捏起皮肤和皮下组织，在皮褶根部用皮褶计测量腹脂的厚度，皮褶计的压力标准为 2 10g/cm 。 三、瘦素受体基因Lys109arg 多态性分析 1．标本的收集和处理 收集人体外周血标本，用Genomic DNA purification kit （Promega 公司）提取基因组DNA ，保 存于－20°C 备用。 2 ．PCR 扩增 采用不对称PCR 扩增以产生单链的靶片段，正向引物（5’- gag aca gct gtt gaa cct aag -3’ ）与荧 光标记反向引物（5’- aga cat cta ttt cat aca ggt atc-3’ ）（ACCESSION NO ：U59249 ）的比例优化为1:10。 PCR 扩增条件为：预变性94°C 5 min ；变性94°C 30 sec ，退火58°C 30 sec ，延伸72°C30 sec ，共30 循环；最后72°C 延伸5 min 。PCR 产物用2% 的琼脂糖凝胶电泳分析。 3 ．寡核苷酸芯片制备 - 104 - 本实验针对瘦素受体第 109 位氨基酸相应的核苷酸突变位点设计相应检测探针并进行优化，使 突变位点产生最佳杂交信号。其优化探针序列为 tgaaggaaggacatttgt 、tgaaggaaggacatttgt 、 tgaaggaacgacatttgt 和tgaaggaatgacatttgt 。待检测的多态性核苷酸位点位于探针序列的中间（阴影字体 表示）。将探针用注射用水稀释至终浓度为100µmol/L，并取5µL 与点样液（5×SSC，0.1%SDS ，1%Ficoll 和5%甘油）等量混匀，转移至96 孔板。用芯片点样仪（Cartisan ）点至醛基化玻片上，每点体积约 为0.5nL ，点心间距为500µm，点直径约为200µm ，每条探针重复点2 次。点样时保持湿度90%， 温度23°C 。经点样的芯片在使用前于室温放置至少24h 。 4 ．芯片杂交、洗涤与扫描 将Cy3-标记的不对称PCR 产物4µL 与杂交液（5×SSC, 0.1%SDS, 1×Denhart 试剂，0.1µg/µL 鲑 精 DNA ）6µL 混合，将 10µL 混合液转移至芯片的杂交区域。芯片置于杂交盒中在42°C 水浴中保 温1 小时。杂交后芯片依次在洗液A （1×SSC, 0.2% SDS）,B （0.2×SSC ）和C （0.1×SSC ）中各洗涤 1 分钟。待干后芯片用激光共聚焦扫描仪GenePix 4000 （Axon Instrument ）在激发波长540nm、发射 波长570nm