新生鼠缺氧缺血损伤脑组织AQP4蛋白表达及意义.pdfVIP

泛珠三角围产医学会议 会议交流 新生鼠缺氧缺血损伤脑组织AQP4蛋白表达及意义 杨钊姚裕家付雪梅四川大学华西第二医院儿科成都610041 研究表明围产期窒息缺氧并发HIBD病理生理机制中。脑水肿是其基本和重要的改变，近年的研 究发现水通道蛋白(AQPs)在组织器官水肿发生的分子机制中可能起着重要作用，AQP4是分布在脑 组织的主要水通道蛋白，具有选择性的水转运功能，已证实AQP4在脑组织水的调节代谢中起重要作 用Ⅲ。但它在新生动物缺氧、缺血脑损伤中的作用还不清楚。本研究在建立HIBD动物模型的基础上， 观察脑含水量，Western 用，为临床治疗HIBD提供实验和理论依据。 1材料和方法 1．1动物分组及HIBD动物模型的建立：健康7日龄SD大鼠(清洁级)，雌雄不限(由四川大学 华西医学中心动物中心提供)，体重11—16克，动物随机分组。对照组：8只，仅切开颈部皮肤，丝 线从颈总动脉下方穿过，不予颈动脉结扎和缺氧处理；HIBD组：进行右颈总动脉结扎和缺氧处理， 乙醚吸入作为基础麻醉，消毒皮肤，2％盐酸普鲁卡因颈部局部麻醉。切开皮肤及皮下组织，分离右侧 颈总动脉，并用7-0灭菌丝线双线结扎。置鼠于常氧空气中30分钟后，放进含8％氧气和92％氮气混 合气体的低氧舱，流量为2升／分，处理1h，环境温度34℃，湿度85％。低氧处理结束后的新生鼠放 回含常氧的母鼠笼中饲养。 器小心于左心室注入灭菌生理盐水10ml，同时剪断颈外静脉直至流出的液体变清为止，再注入4％多 聚甲醛(用PH7．4的PBS配制)10ml，在灌注后立即断头取全脑，并立即将之保存于4％多聚甲醛(用 PH7．4的PBS配制)溶液中固定72h以上。将固定的鼠脑从垂体水平沿冠状位分为前后两半，脑组织 经全自动脱水机脱水，石蜡包埋，冠状位切片(3Um)。标本脱蜡，二甲苯透明，苏木素、伊红染色 (HE)，光镜观察病理改变。 1．3脑组织含水量测定：处死动物后，取脑组织约100mg用电子天平(GMBHR200D型，精度 1／10万)称取湿重量后在1100C电热烘干箱(芬兰GBS公司生产)中烘干至恒质量。 计算脑含水量(公式)=(湿质量一千质量)／湿质量×100％。 1．4Western blot检测脑组织AQP4蛋白 1．4．1脑组织总RNA提取： 行脑组织总RNA提取：取澄清的Trizol裂解产物至一新的离心管中。室温放置5分钟，使样品充分裂 4℃离,5,15分钟， 解。每毫升TrizoliJI入0．2ml氯仿，猛烈晃动15秒，室温放置2—3分钟。12000×g 然后吸取含总RNA的上层水相至一新的离心管中。按每毫升最初的Triozol加入0．5ml异丙醇，颠倒数 4C离,5,10分钟，在管底可见胶状RNA沉淀，弃上清。每毫升 次混匀，室温沉淀10分钟。12000×g 最初的Triozoli0【l入lml75％乙醇，颠倒混匀。7，500Xg4C离心5分钟，弃上清。再用离心机离心 DEPC水溶解，一70℃冻存。测出的A260／280 (5000rpm，1秒)，小心吸尽液体。待RNA略干后，加入20ml 值1．6-2．0之间。最后提取的总RNA行l％琼脂糖凝胶电泳： 1．4．2样本准备： ‘ 浆，在沸水中煮沸15分钟，直至全部溶解。12000×g离心i0分钟。去除沉渣，吸取上清备用。 1．4．3蛋白质的单向SDS凝胶电泳： 按照厂家的说明书安装好电泳槽装置，先在两玻璃板的缝隙间加入分离胶，留出灌注堆积胶的 空间。用注射器小心在分离胶上面加一层双蒸水，使凝胶与空气隔绝以防止氧气抑制凝胶的聚合反 394 泛珠三角围产医学会议 会议交流 应。待水胶面清晰后，说明分离胶已经制好。倒掉分离胶上层的水，迅速加入堆积胶并插上Teflon 梳子，室温下聚合