腺病毒介导的GFP在鸭胚成纤维细胞中的表达及RNA干涉.pdfVIP

禽类传染病 3．4DHv-I在组织器官的分布特点与病毒特性的关系 本试验结果表明，DHv-I抗原的阳性染色出现在被感染细胞的细胞浆，说明DHv．I主 要定殖于细胞浆。符合RNA病毒的定殖特征。肝脏强阳性，阳性染色主要是技感染的肝细 胞的细胞浆，而肝是重要的代谢器官。肝细胞能吸收有毒物质。经分解或与其他物质相结合， 变成无毒物质起着解毒作用，肝血窦中的枯否氏细胞也有着吞噬防御作用。所以当肝组织内 部受损时，必然使得机体的保护防御功能削弱，病毒在肝脏大量繁殖，待病毒突破肝脏屏障 后经胆道入肠，这在一定程度上解释了文献【19】报道的利用D01．EusA检测DHv-I强毒在雏 鸭体内的代谢和分布结果。肾小球、肾小管都有阳性细胞存在，染色区域为细胞间质、被感 染细胞的细胞浆。肝和肾的细胞被DHv．I感染的最为严重，表明DHv．I对肝和肾细胞有 明显的亲嗜性。这正好能够解释为什么DHv-I可在原代鸭胚肾细胞和原代鸭胚肝细胞上培 养的原因”I．整个脾脏弥散分布阳性细胞，主要是细胞质阳性，而脾脏是身体最大的免疫器 官，也是机体最活跃的免疫器官，同时它是机体的造血器官，也是对血源性抗原产生应答的 主要场所。所以当其受到DHV．1严重侵染时，必然使得体内的免疫系统产生功能性障碍， 有利于DHv．I的大量增殖和扩散，出现了DvH潜伏期短、病程短的临床特征。肠绒毛上皮 细胞细胞浆阳性反应最强，说明病毒已经在肠绒毛上皮大量繁殖，使DHV可经泄殖腔直接 排出体外，直观的解释了汪铭书等报道的应用葡萄球菌A蛋白协同凝集试验在粪便中检测到 DI{v．I强毒的实验结果llq。因此有理由认为自然界中DHv·I和其它肠道病毒属的病毒一 样，其传染可经粪．口途径迅速传播。 参考文献 腺病毒介导的GFP在鸭胚成纤维细胞中的 表达及RNA干涉· 孟宇航矫承扬发龙邛书岳率” (西南民族太擘生命科学与技术学院，四川成都61004I) 摘要原代细胞具备二倍体的遗传性、采；晕方便，可作为RNA干涉(RNAi)效果的体外评价系统，可 方便地研完病毒与宿主相互作用机制及英基因功能．也可作为辩选有效的siRNA分子用于病毒感染防治的 平台．本研究将不同感染复数(MOI)的绿荧光蛋白重组腺病毒(Adv—GFp)感染鸭胚成纤维细胞(DEF)，用 漶式细胞仪分别测定感染后24．36，48和60hGFP表达效率及时细胞的影响；此外，用脂质体转染试科 MOI的Adv-GFP． 将化学合成的靶向GFP基固的小干扰RNA《GFP．siRNA)转袋DEF。6h后再感染200 能显著干涉Adv．GFP介导的GFP基因在DEF中酌表遮，相对抑制率为98．56％．证明DEF细胞与其它真 搬生物一样存在RNA干涉机翻，AdvGFP在一定的Mo】葱固内对DEF是安全的．且转染效率较高，是 理想的外源基因表达戢体；奉研究为RNA干涉技卉撕充DEF易感病毒和鸭的基固组功能麒及病毒感染防 治奠定了基础． 关键词鸭胚成奸堆细胞RNA干净腺病毒载体缘荧光蛋白感染复敷 绿荧光蛋白(Gr∞nFluor∞c蚰tPro忙in，GFP)基因是M础se在1974年从研究水母的 发光机制中分离纯化的，其显著特点是能在不加外源物质的情况下。受到紫外光激发时就能 在原核和真核活细胞中发出清晰可见的绿色荧光。且荧光性质稳定。作为一种理想的活体标 记分子，GFP已广泛应用于对活细胞的各种研究中”“。腺病毒(Adenovin塔，Adv)具有高滴 度、高稳定性、高转染效率、非致癌性、感染细胞范围广等特点。是理想的外源基因载体， 目前重组腺病毒载体己广泛的应用基因研究，基因治疗等方面’舛1。RNA干涉(RNA (Pos愉aIlsc—ptio．nalgene RNA．dsRNA)能特异地降解相应的mRNA而使其目的基因表达受到抑制．产生如同目的基 中国畜牧兽医学会动物传染病学分会第十二次学术研讨会 因突变的缺陷表型．这种由dsRNA介导的基因抑制作用被称为RNAi。RNA洧广泛的应用前 景，例如研究功能基因组、基因治疗、信号传导、肿瘤研究和生物遗传改良等方面。本试验 DEF中的表达。 1材料和方法 1．1材科 293细胞由南京农业大学芮荣博士惠赠；GFP重组腺病毒载体(Adenovi丌l》—G