六种荧光蛋白基因在蒙古羊成纤维细胞中的时空表达.pdfVIP

第十次全国畜禽遗传标记研讨会论文集 六种荧光蛋白基因在蒙古羊成纤维细胞中的时空表达’ 刘长青，娜日苏，陆涛峰，关伟军’ (中国农业科学院北京畜牧兽医研究所，北京100094) 和pDsRedl-Nl等六种荧光蛋白基因导入蒙古羊体外培养细胞中，对基因的时空表达、阳性细胞 生长与增殖状况、细胞凋亡与细胞活力以及提高基因表达率的最佳方法等方面进行了深入的研 究。试验结果表明：六种荧光蛋白基因在转染后24h、鸽h和7211的转染率在12．3％一63．3％之间， 经多重比较，各试验细之间有较大差异。转染24小时后，六种荧光蛋白都均匀地充满细胞质和 细胞核，只有囊状小泡没有标记荧光；转染484、时后，EGFP、EcFP和EⅥ平仍在整个细胞中均 匀表达，呈弥散分布状态，随着表达量的增加，在细胞核局部呈现决状或颗粒状的基因表达产 物；DsRed荧光蛋白基因则主要在细胞核膜周围呈现由诸多颗粒状表迭产物组成的环状轮廓； 在优化的条件下，细胞凋亡率、阳性细胞的形态、生长与增殖状况与对照组比较没有明显的影 响(PO．05)。此项研究对于标记基因、核移植反转基因动物克隆等研究具有重要的参考价值。 关键词；蒙古羊；成纤维细胞系；荧光蛋白；细胞定位；脂质体 表达、无种系依赖性，且无需抗体、辅助因子、酶底物等成分即可产生荧光的特点是以往已报道的lacZ、 C罔r等基因和普通荧光标记物无可比拟的，因此作为标记基因被广泛应用于活细胞和生物体内动态观察 过激光共聚焦显微镜观察，并对外源基因在体外培养成纤维细胞的时空表达、阳性细胞生长与增殖状况、 细胞凋亡与细胞活力以及提高基因表达率的最佳方法等方面展开了深入的研究，为充分利用家畜体外培 养成纤维细胞进行基因表达与调控、转基因、基因敲除和核移植等研究提供技术支撑和保障。 1材料与方法 1．1材料 433．588nm之间。蒙占羊成纤维细胞为本实验室培养。 DMEMffIi曲Glucose，Gibco)、胰蛋白酶(Trypsin 2000，lnvitrogen)、大肠杆菌感 Hyclone)、台盼蓝(TrypanBlue，Sigma)、阳离子脂质体(Lipofectamine 受态细胞(DH5a，本实验室保存)、DAPI(Roche)。 1．2方法 1．2．1外源基因表达靶细胞的培养 取蒙古羊新鲜耳缘组织，采用组织块贴壁培养法进行培养、传代和冻存【2】，建立其成纤维细胞系， 作者简介，刘长青(1978一)男，山东人，博士生；研究方向：分子细胞生物学 通讯作者：关伟军(1966)男，黑龙江人，博士，研究员，博导；研究方向：细胞与分子生物学。Email： wjguan86@[ascaas．net．cn Animal Bulletin Biotechnology 为外源基因的表达提供靶细胞。 1．2．2质粒的制备及鉴定 四种荧光蛋白质粒热击转化大肠杆菌DH5d，转化方法参考分子克隆实验指南(第三版)，用Plasmid Midi I和Xba I双酶切，琼脂糖电泳鉴定酶切结果。 (Lqtrospecll00pro)测定质粒DNA浓度，用Nhe 1．2．3脂质体介导法转染成纤维细胞 采用脂质体介导法删，将外源基因pEGFP--C1转入蒙古羊体外培养成纤维细胞中以探讨脂质体和 DNA量对转染效率的影响，实验分组如表l所示。 表1质粒DNA转染分组 TablelThegroupsofgeaetr∞sfeefioa 注：溶液A：分别将1．0、1．5、ZOIlgDNA溶于1001al不含血清的培养液中； 溶液B：分别将4、6、8Ⅲ脂质体与无血清培养液混合至100．I。 按照2．0I_tgDNA和6．0lal脂质体的优化后的条件对体外培养靶细胞进行转基因研究。 1．2．4阳性细胞形态观察与台盼兰