全层铺片技术研究消化道神经丛和Cajal间质细胞.pdfVIP

76 解剖学研究2013年第 35卷第 1期 AnatRes，2013，Vo1．35，No．1 · 技 术 方 法 · 全层铺片技术研究消化道神经丛和Cajal间质细胞 张国权， 孙海梅 ， 夏 白娟 。， 李小双 ，康 倩 ， 江 涛 (武警后勤学院组织胚胎学教研室，天津 300162) 消化管的肠神经系统[-]及 caial间质细胞[2_在调节 胃 异性；弃去多余孵育液，滴加 0．1％BSA稀释的一抗 (大鼠 肠的舒缩活动中起着十分重要的作用，如果能直观地全面 抗小鼠c．Kit单克隆抗体 ，稀释度 1：200。购 自eBioscience 地观察到这些细胞在肌间或者肌内的整体构象和形态变 公司：羊抗小鼠ChAT多克隆抗体，稀释度 1：100，购 白 化 ，对于更好地理解消化管壁的结构以及它们与胃肠运动 Novus公司)．室温下湿盒内孵育 1h，然后 4℃过夜 ；漂洗 3 相关疾病的关系 ，都有很好的作用。使用全层铺片与免疫 次后 ．滴加 0．1％BSA稀释的二抗 (FITC标记的驴抗羊 IgG， 组织化学染色相结合可以达到这个要求 [“]。利用全层铺片 1：100；Cy3标记的羊抗大鼠XgG，1：200，均来 自Invitrogen公 可以很好地补充冰冻切片或石蜡切片在实验观察中的不 司)，湿盒内室温避光孵育 1h；漂洗 3次后 ，水溶性荧光封 足。在制备全层铺片时，由于所使用的实验动物和固定方 片剂封片，荧光显微镜或激光共聚焦显微镜下观察。 法的不同以及制作手法的差异 ，最后得到的图片效果差别 2 结 果 很大 。本文就制备 胃肠道肌间胆碱乙酰转移酶 (choline acetyhransferase，CHAT)阳性神经元铺片和 Caial间质细胞 低倍镜 (图 1C)可见，标记为绿色荧光的胆碱乙酰 中的一些细节及体会进行了阐述，谨供同行参考。 转移酶存在于胃肌间神经丛。神经节内部分神经元 以及 神经节之间的初级纤维 ．次级纤维 ．三级纤维均呈 ChAT 1 材料和方法 阳性。高倍镜下 (图 1D) 可清楚看到胃肌间神经节内 1．1 动物与器械 ChAT阳性神经元的形态以及颗粒的分布情况。标记为红 成年 BALB／c小鼠，雌雄不限。瑞士生产的眼科镊子2 色荧光的c．Kit蛋白表达于胃肠道的Cajal间质细胞。结果 把，眼科剪刀 2把。解剖显微镜 ，4号手术线 ，玻璃平皿 ，5 证实，胃肌间神经丛周围的caial间质细胞有2~3个细长的 mL注射器。 突起 ，突起反复分支。彼此间相互连接形成致密的细胞网络 1．2 方 法 (图1E)。纵行及环形的平滑肌层中Cajal间质细胞为双极 1．2．1 取材及 固定 1％戊巴比妥钠麻醉动物后处死 。腹 性，胞核椭圆形 ，有2个细长的突起 (图 1F)；结肠肌间神经 正中切 口打开腹腔，快速取完整 胃、部分小肠及结肠，置于 丛周 围的Caial间质细胞所形成 的细胞网络要相对稀疏 含预冷0．01mol／LPBS的平皿中。PBS反复冲洗以去除腔 (图lG)。 内容物。结扎 胃的贲门端或者肠管的一端 ，用注射器将预 3 讨 论 冷的丙酮或 4％多聚甲醛 (4％PFA)固定液注入 胃或肠腔 内，使其维持最大充盈状态 ，再结扎另一端(图 1A、B)。置 全层铺片是研究 胃肠道肌间神经丛和 Cajal间