微生物药物创新与优产的人工合成体系.doc

项目名称： 微生物药物创新与优产的人工合成体系 起止年限： 2012.1-2016.8 依托部门： 教育部  1.维持细胞基础代谢和执行基本生命活动的必需基因；2.在特定生境下，克服某些环境压力，强化生存的条件必需基因；3.非必需基因。链霉菌作为产生天然药物最大的类群，其线性染色体结构具有核心必需区和柔性可变区，是作为微生物药物底盘细胞的最佳选择。为建立优质的微生物药物底盘，首先应用比较基因组学预测底盘链霉菌的核心必需区和柔性可变区，从后者中进行连续的大片段缺失，使染色体结构更为稳定；从前者中去除可能的次级代谢合成基因簇以及平行转移获得的可移动元件，使简化的底盘细胞进行基本生命活动所需能量更小，生活周期更短。另外一方面，强化或加载一些天然药物合成的共同前体物合成基因，改善菌体生长性状及抵抗发酵过程噬菌体污染的限制-修饰基因，使优质化底盘细胞获得新的生命优势，实现底盘细胞的遗传稳定性和普适性，为微生物药物的高效合成提供平台。 工程化设计生物合成体系的适配性机制 在对微生物药物合成及调控机理理解的基础上，应用计算生物学方法构建特定构效关系的生物元件及途径，经热力学评价和动力学模拟，为人工合成体系提供理论指导。以工程学的原理对药物合成途径进行设计，最终在底盘细胞上组装生产线，需要解决途径中各元件间、路径与底盘之间的适配性这个科学问题。为探索适配性机制，可以在体外及体内两个层面上进行。在体外对合成途径进行检验和优化可以绝缘胞内其它因素的干扰，即根据药物的结构特征，设计或构建的新合成途径应该满足反应热力学基本原理，再根据合成途径中的各反应类型，从功能元件库中挑选适宜的元件进行体外组合或装配，模拟计算合成途径的反应进程，检测反应物的流量变化，确定合成途径中的节点元件，对其进行设计和优化，以及环境因子对人工合成途径的影响。在体内需要解决合成途径与底盘细胞其它代谢途径的适配性问题。在封闭的细胞内，其适配性问题主要反映在物质与能量的动态平衡，即结构性物质的流向和电子的传递。基于底盘链霉菌基因组的解析，模拟人工合成途径在代谢网络中的运行，检验代谢流，设计与重新组装调控元件，调节人工合成途径与底盘的适配程度是构建人工生物体系进行药物合成的必然过程。 4. 人工合成生物体系对环境的应答机制 在底盘细胞基础上人为构建合成途径，必然会对整个调控网络带来影响，也反映在人工合成生物体系的生理指标方面。因而实现药物的高产量、低成本生产，还取决于人工生物体系对外界环境的应答机制，主要包括抗逆、与胞外的物质交换和对特定激活信号的响应。由于对复杂生命系统工作原理的了解还存在太多的盲区，因而在基因及基因组的组成与结构水平上研究其抵御生物、物理和化学等因素破坏作用的机制；揭示重要物质的跨膜机理；在调控网络、细胞及细胞群的层面分析人工生物体系对胞外物理化学信号的响应机制。这些都有助于我们深入认识生命规律，所获得的科学认识还为我们在合成途径、调控元件、代谢网络的设计与组装等方面提供理论支撑。 主要研究内容 （针对科学问题1）生物元件挖掘与人造功能器件的合成。 针对微生物药物生物合成过程中药物前体合成（初级代谢），药物合成（次级代谢）和药物转运等步骤中涉及到的功能元件和调控元件进行挖掘、分类、定义以及在放线菌底盘生物（链霉菌FR-008）进行标准化。着重于如聚酮类（红霉素、安丝菌素等）、C7N氨基环醇类（伏格列波糖等）、β-内酰胺类（头霉素、克拉维酸等）等合成途径的元件挖掘，从深海极端环境和近海红树林环境中获取更多上述药物生物合成的元件以及应对复杂环境应答的调控元件；对具有新型糖基化修饰功能和调控功能的生物元件进行挖掘，并对其功能和适用范围加以分类；利用蛋白纳米纤维和病毒蛋白骨架自组装的有序特性和特殊的空间结构，构建功能化人工蛋白“脚手架”，实现对功能元件的逐级组装和按设计比例组装，使其发挥最大功能。 （针对科学问题3）生物元件、路径和网络的模拟与设计。 摸索出一套具有高模块性和通用性的调控元件设计与构建、代谢网络功能控制模块识别和设计方面的计算生物学方法和计算-实验结合技术，构建基于简化氨基酸的随机肽和功能酶库；针对蛋白质改造与设计，提出和发展具有构象和环境依赖特性的新型可极化分子力场以及与之相应的可极化溶剂化模型，最终获得一套崭新的蛋白质改造与设计的理论计算方法和计算程序;设计完成自动获取代谢反应转换模式以及构建基于代谢网络的生物合成途径设计方法相关的技术，构建基于基因组规模代谢网络的生物合成途径设计信息化平台;在放线菌底盘（链霉菌FR008）中插入井冈霉素等微生物药物合成基因簇，研究放线菌底盘通过SOS反应和毒素-抗毒素系统维持外源元件稳定遗传的调控机制。 （针对科学问题1）催化体系优化与人工组装。 面对人工合成体系的需求，开展酶催化模块的理性设计、