浓香型大曲中酯化酶测定方法的研究.docVIP

酿 酒 HQUOR MAKING V01．30．No．2 Mar．， 2OO3 文章编号：1002—8110(2003)02—0018一o4 RC00H +NaOH— ÷ RC00Na+ROH 2NaOH+ Sq— 一Na2S04+2H20 0，2 优化后酯化力测定方法的原理 近年来，酶在有机相中的生物催化作用因其潜在的工业 用途而日益受到人们的重视[117,18】。与水相催化相比，有机 介质可以增加酯酶的热稳定性，增加非极性底物的溶解度， 减少反应副产物，还可能影响酶的底物特异性及酶反应的平 收稿日期：2o03—01—16 衡方向和反应速度。有机溶剂相中酯化反应平衡点与速率 同溶剂中水含量密切相关，有机溶剂作为反应介质时，在一 个狭窄的初始含水量范围内，酶有较高的催化酯化活力。当 初始加水量较低时，酶分子由于不能获得形成活力构象所必 需的水，表现出较低的催化反应活力；当体系中水初始含量 高时，从物理状态来看，在反应的初始阶段酶粉即发生粘结， 产生吸附现象，无法均匀分散，故反应速率也降低。对本研 究而言，所加入的酶不是纯酯化酶，而是加入一定量的带水 分的大曲，大曲含水量在12％左右，此时反应体系中的含水 百分比约为6％左右，这虽然高于一般反应介质的最佳含水 量【181，但仍处于微水范围。而且，反应所利用的酯化酶是从 大曲颗粒里浸出来的，酶量很少，加上曲粉的间隔作用，这样 的含水量是不会发生酶粘结现象的，因此采用无水有机溶剂 与试剂进行酯化力的测定方法是可行的。 现以正庚烷为有机溶剂来代替水相进行酯化力测定方 法的优化，以期在尽可能短的时间内鉴别出大曲酯化能力的 高低。由于大曲的酯化反应是可逆反应，因此不仅要优化条 件以确保酯化能力最强，同时还要确保在此条件下分解能力 最差，只有酯剩余量多的条件才是最适条件。 1 试验材料 1．1 大曲 1．1．1 粉碎 用微型植物粉碎机粉碎。筛孔~lmm。 1．1．2 分样 采用四分法。通常样品需要量500 引。 1．1，3 大曲样品分类方法 见参考文献[23】。 1．2 试剂 1．2．1 正庚烷，AR级，每瓶试剂(500ⅡlL)加入3og无水硫酸 钠。 1．2，2 己酸，AR级，每瓶试剂(500ⅡlL)加入30g无水硫酸钠。 1．2．3 无水乙醇，AR级，每瓶试剂( )加入30g无水硫 酸钠。 1．2．4 pH4，6醋酸一醋酸钠缓冲液，配制方法见参考文 献【6J。 维普资讯 第2期 王耀，等：浓香型大曲中酯化酶测定方法的研究 ·l9 · 1．2．5 100m~100mL己酸乙酯的20％(v／v)乙醇溶液，配制 方法见参考文献 。 1．3 仪器 恒温培养箱：上海恒三仪器厂。 2 测定方法 2．1 传统酯化力的测定方法具体见文献【6J。 2．2 优化后酯化力测定方法 影响己酸乙酯合成反应的因素有很多，做单因素分析实 验，对加入底物酸(己酸)与乙醇的浓度、加曲量和反应温度 等进行优化。每间隔一段反应时间，取出上清液0．2mL于 50mL三角瓶中，加入5mL水，1滴酚酞，用O．025MNaOH滴定 至酚酞终点，记下消耗的毫升数。计算公式为： 降酸％ =(Vl—Vo)×100％vo 式中：v0一反应前消耗NaOH的体积(mL) vl—— 反应一段时间后消耗NaOH的体积(mL) 3 结果与讨论 3．1 酯化力 3．1．1 传统方法测定酯化力 传统方法采用100mL 1％的己酸、乙醇溶液，加相当于5g 干曲的曲量，在30—32℃ 酯化100h，用NaOH皂化己酸乙酯 来求得己酸乙酯量。下面对1 、2 曲及陈曲的酯化力进行 测量，以便进行优化的研究(表2)。 表2 传统方法测定酯化力(三次平均) 从表2可以看出，大曲的质量越好，酯化力越高；贮存时 间短的曲(三个月以上)，酯化力越大，但陈曲的酯化力不高。 因此，仅从酯化力考虑，大曲的贮存时间也不可过长，否则， 酯化力会大幅度下降。 3．1．2 优化方法的建立 影响酶在有机溶剂中催化合成己酸乙酯反应的因素 有 ．2 】：第一，底物浓度比(酸、醇浓度比)。第二，加酶量。 加酶量有一个临界值，当加酶量小于临界值时，会影响反应 平衡转化率；当加酶量超过临界值后，平衡转化率不再发生 变化，而反应速度随着酶量的增加而加快。第三，底物的浓 度、尤其是有着较强极性的己酸浓度，直接关系着酶的催化 活性和稳定性。第四，反应温度。它既关系着酶的活性，也 关系着反应速度。第五，有机相中，酶的催化活性与反应系 统的含水量密切相关，只有最适含水量时，酶最稳定，且表现 出最大活力。 3．1．2．1 底物酸与醇的比例对酯化反应的影响 理论上，己酸与乙醇反应的摩尔比为1：1，为使反应向己 酸乙酯方向顺利进行，醇应略过量。设定乙醇的三个梯度。 定量：正庚烷30mL，己酸0．15tool，绝