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研究蛋白相互作用的方法： 酵母双杂交 酵母双杂交的缺点 1) 相互作用必须在酵母中进行,许多外源目标蛋白在酵母中表达天然活性已经发生变化; 2) 各种原因造成的假阳性,例如一些受试蛋白本 身可能激活了报告基因的转录或在酵母双杂交 系统中相互作用的蛋白在其天然环境中处于不同 细胞器,并不发生相互作用; 3) 必须通过酵母细胞培养才能观察到结果,耗时较长. Identifying Protein-ProteinInteractions: FRET Identifying Protein-ProteinInteractions: FRET 青色荧光蛋白（cyan fluorescent protein, CFP）、黄色荧光蛋白（yellow fluorescent protein, YFP）为目前蛋白-蛋白相互作用研究中最广泛应用的FRET对。CFP的发射光谱与YFP的吸收光谱相重叠。将供体蛋白CFG和受体蛋白YFG分别与两种目的蛋白融合表达。当两个融合蛋白之间的距离在5-10nm的范围内，则供体CFP发出的荧光可被YFP吸收，并激发YFP发出黄色荧光，此时通过测量CFP荧光强度的损失量来确定这两个蛋白是否相互作用。两个蛋白距离越近，CFP所发出的荧光被YFP接收的量就越多，检测器所接收到的荧光就越少。 FRET 和BRET 技术对仪器的要求高,需要复杂的数据分析. 同时,这类方法检测的是供体和受体的荧光强度的变化. Bimolecular FluorescenceComplementation (BiFC) 2000 年, Ghosh 等首次报道了1 个借助反向平行的亮氨酸拉链介导的GFP 重组实验. 该实验选用了易被检测的GFP 蛋白,将其从氨基酸Gln157-Lys158 位切开,把1 组反向平行的亮氨酸拉链分别连接到GFP 的N 端和C 端.,将1 个亮氨酸拉链(NZ) 通过1 个连接肽连接到GFP 的N 片段的第157 个氨基酸上,另1 个亮氨酸拉链(CZ) 连接到C 端片段的第158 位氨基酸. 在体外和体内(大肠杆菌BL21 中) 分别证明了,只有借助亮氨酸拉链的相互作用,GFP 的2 个多肽片段才能够靠近,重新形成完整的GFP 蛋白,并发射荧光. 2003 年, Hu 和Kerppola[29 ] 系统地研究了GFP 及其3 个不同颜色的突变体蓝色荧光蛋白(BFP) ,青色荧光蛋白(CFP) 以及黄色荧光蛋白( YFP) 的BiFC 现象. 他们把GFP ,BFP ,CFP ,YFP 从氨基酸155 位和173 位分别切开,把切开的N 端片段用其颜色和位点命名,如NY155 ,NG173 等 BiFC 技术正是利用该荧光蛋白家族的这一特性，在环结构的特异位点将荧光蛋白切成N 端片段和C 端片段两部分后，再由一小段氨基酸序列(linker)分别与目标蛋白连接. 重组好的基因构建入载体，共转染细胞. 两段重组基因在细胞中融合表达，若目标蛋白间存在相互作用，通过linker 牵引荧光蛋白的N 端片段与C 端片段就能够相互靠近，进而形成荧光蛋白生色团重新发出荧光. 因此，在荧光显微镜下检测是否有互补荧光产生，就可以推断出两目标蛋白是否发生了相互作用。 Bimolecular FluorescenceComplementation (BiFC) Bimolecular FluorescenceComplementation (BiFC) 优点： BiFC系统对仪器要求低、数据处理相对简单,由于只是检测荧光的有无, 因而背景干净, 检测更加灵敏.　重建后的荧光蛋白结构较稳定,双分子荧光互补技术还可以用于研究蛋白质之间的弱相互作用或瞬间相互作用[ BiFC技术的最大缺陷是多个BiFC 系统对温度敏感. 温度高时,片段间不易互补形成完整的荧光蛋白. 一般在30 ℃以下形成互补效应好,温度越低,越有利于片段之间的互补,这就对研究细胞在生理条件下的蛋白质相互作用带来不利因素. 目前,只有基于venus、citrine 和cerulean 的3 个双分子荧光互补系统可以在生理温度条件下实现片段互补[30 ] . 此外,BiFC 系统需要2 个荧光蛋白片段互补,重新形成完整的活性蛋白以及发生荧光蛋白自体催化过程,不同的BiFC 系统往往需要几分钟到几小时完成该过程,因此观察到的双分子荧光信号滞后于蛋白质的相互作用过程,不能实时地观察蛋白的相互作用或蛋白复合物的形成过程. * *