产阿魏酸酯酶乳酸菌的乳杆菌筛选以及基因克隆.docVIP

产阿魏酸酯酶乳酸菌的乳杆菌筛选以及基因克隆 摘 要：运用平板法和高效液相色谱法筛选出一株具有阿魏酸酯酶活性的发酵乳杆菌（Lactobacillus fermentum ATCC9338），其酶活力为260mU/L，并成功运用鸟枪法对该菌株进行阿魏酸酯酶克隆并测序，为产阿魏酸酯酶益生菌的开发提供理论依据。 关键词：阿魏酸酯酶，乳酸菌，平板法，高效液相色谱法，鸟枪法 Screening and gene cloning of ferulic acid esterase by Lactobacillus strains Abstract：The production of feruloyl esterase activity by Lactobacillus could be screened by assaying transparent zone on the selective agar plate and high efficiency liquid chromatography. The results of experiment showed that only Lactobacillus fermentation ATCC 9338 had feruloyl esterase activity，and the enzyme activity was 260mU/L. Shotgun cloning method was used to clone and sequence feruloyl esterase gene from this strain. This study will provide theoretical basis for feruloyl esterase-producing probiotics. Key words：feruloyl esterase ； Lactobacillus ； plate detection ； high efficiency liquid chromatography ； shotgun sequencing method 中图分类号：TS201.2 文献标识码：A 文 章 编 号：1002-0306（2013）20-0199-05 收稿日期：2013－05－09 * 通讯联系人 作者简介：卢颖欣（1988-），女，硕士研究生，主要从事乳酸菌基因方 面的研究。 阿魏酸是桂皮酸的衍生物之一，它在中药材例 如当归、酸枣仁等中的含量很高，也是其中的有效成 分。阿魏酸的毒性低，而且具有镇静、抗癌、抗氧化、 抗动脉粥样硬化、抗血小板聚集、降血脂等独特的功 能 [1] ，因此在食品、医药工业上得到广泛的应用。但阿 魏酸在植物中大部分以交联的形式存在，人和动物 不能直接吸收这类阿魏酸，必须依靠微生物产生酯 酶将阿魏酸游离出来。阿魏酸酯酶（EC 3.1.1.73）是 能够水解阿魏酸糖酯中的酯键，将阿魏酸释放出来 的酶，它能与其他水解酶相互联合作用，较为彻底地 降解细胞壁中的多糖和木质素 [2-3] 。 自MacKenzie等首次在链霉菌中发现阿魏酸酯 酶以来，至今已分离纯化近30种阿魏酸酯酶，但主 要集中在青霉和曲霉，只有少数是来自于细菌，例 如嗜酸乳杆菌 、 枯草芽胞杆菌等 [4 -10] ，而且它们的 阿魏酸酯酶的酶学特性以及氨基酸序列都有所不 同 [13-15 ， 17-18 ， 20-21] 。由于天然真菌生长、酶产量以及真菌 对生长条件的种种限制都制约着酶法制备阿魏酸的 工业化生产，而原核细胞表达的酶更能高效地利用 大肠杆菌进行表达生产。1998年，Donagy和McKay筛 选了近50株革兰氏阳性菌是否具有阿魏酸酯酶活 性，结果发现Lactobacillus fermentum NCFB1751的活 性最高 [11] 。 乳酸杆菌作为益生菌具有良好的调节肠道微生 态等益生功能 [13] ，而产阿魏酸酯酶的乳酸杆菌除 了具备普通益生菌的功能外，还能通过阿魏酸酯酶 的特性，水解阿魏酸酯中的酯键，释放出阿魏酸， 有利于人体健康。Bhathena等 [12] 的研究表明，口服用 Lactobacillus fermentum 11976所作的胶囊能有效地 提高人体肠道内阿魏酸酯酶的含量，从而提高食物 中阿魏酸的生物利用率 。 目前，阿魏酸酯酶的活力检测方法有很多，其中 包括高效液相色谱法 [22] 、毛细管区代电泳等 [4，9-10] 。 Donagy和McKay运用平板法筛选了近50株具有阿魏 酸酯酶活性的细菌 [11] ，此方法简单易操作，但是仍存 在一定的缺点：在平板上产生能产生透明圈的细菌 只能证明其具有利用阿魏酸酯的能力，而是否具有 阿魏酸酯酶的活性还需要进一步的检测