应用蛋白G吸附法检测梅毒特异性IgM抗体及临床应用.pdfVIP

应用蛋白G吸附法检测梅毒特异性IgM抗体及临床应用 顾志冬孟俊栾海萍刘梅花樊绮诗 (上海交通大学N_-学院附属瑞金医院检验科，上海，200025) 【摘要】目的应用蛋白G吸附法，建立了一种梅毒特异性IgM抗体检测的新方法。方法以蛋白 G为吸附剂，结合TPPA的检测方法，对梅毒特异性IgM抗体进行检测；应用该方法对99例梅毒总抗 体阳性的新生儿血清标本进行检测，并与其它方法进行比较。结果选定了蛋白G吸附和解离的时间和 孵育温度，确认了蛋白G吸附的能力，4例阳性标本与免疫痕迹法结果相符合。结论本研究建立的蛋 白G吸附法检测梅毒特异性IgM抗体的方法适用于新生儿IgM抗体的检测，经进一步临床试验后，值 得推广应用。 梅毒是由密螺旋体属中的苍白螺旋体引起的一种慢性、系统性性传播疾病。如孕妇为梅毒现症感 染，则梅毒可以通过胎盘传给下一代而发生胎传梅毒即先天梅毒【1之】。由于先天潜伏梅毒没有任何临床 症状，仅依靠于实验室的诊断，所以早期诊断对患儿疾病的控制十分必要。 检测到疑似先天梅毒的新生儿血清样本中的梅毒特异性抗体lgM是确诊先天梅毒的唯一指标，观 察新生儿一段时间内的梅毒总抗体滴度的变化虽也是一种手段，但也存在延误最佳治疗时间的缺点。 法等。但直接检测样本中的梅毒特异性IgM抗体往往受到类风湿因子和IgG竞争性抑制的影响，所以 通常采用对样本进行预处理后再进行IgM型抗体检测【3‘4J，采用这种方法进行检测主要包括19S-IgM一 荧光抗体吸收试验(1 9S—IgM—FTA．ABS)，或者通过亲和层析柱、抗原抗体反应等方法来预先除去标本 中IgG，再检测梅毒特异性抗体。但这些方法都需要特殊试剂，价格昂贵。 蛋白G是一种分离自G型链球菌的细胞壁蛋白【5‘6 J，重组的蛋白G具有可特异性的结合人IgG的 Fc段，而不吸收人IgM的特点。本实验尝试利用蛋白G作为吸附剂，先吸附样本中的lgG，再通过 TPPA检测血清中梅毒特异性IgM抗体的方法，现汇报人如下： 材料和方法 一、试剂 1．TPPA试剂由日本富士公司提供，批号为WN61006，有效期 HealthcareBio—Sciences 2．含有蛋白G的缓冲液，提供厂商GE AB。 3．TP免疫印迹法试剂由欧蒙公司提供，批号为，有效期为。 4．其余试剂均为国产分析纯。 二、样本 自上海市儿童医院，12例来自儿科医院，10例来自瑞金医院。所有标本均新鲜冻存于．20℃备检。 2．其余所用标本为瑞金医院检验科提供，新鲜血清标本待检。 三、方法 1．TPPA、TP-免疫印迹法、19S—IgM—TPPA检测按试剂盒说明书操作。 2．蛋白G的使用 (1)缓冲液的配制： A、B缓冲液均含有0．1％叠氮钠，4℃保存。 (2)吸附 离心3min，吸取上清液待检。 (3)解离 用缓冲液B对使用后的蛋白G的亲和介质解离3次，解离液体积第一次100ul，后两次为300ul， 每次37。C孵育30分钟。再生后的蛋白G保存在缓冲液A100ul中。 (4)再活化 多次使用后的蛋白G放置于微小层析柱，以10倍体积解离液4次冲洗，重新保存于缓冲液A中备 用。 (5)标本的检测 上清液按照TPPA方法检测(样本不需预稀释21倍)，并判断结果。 (6)结果的判断 将吸附后上清液进行TPPA检测(标本均不需稀释)，如吸附后标本呈阳性反应则判断为IgM抗体 阳性，反之判断为IgM抗体阴性。 结 果 一、不同样本稀释液对检测结果的影响 1．对TPPA检测结果的影响：用TPPA试剂盒自带的样本稀释液、缓冲液A(结合液)及缓冲液B (解离液)分别作为TPPA样本稀释液，对同一组9例梅毒特异性阳性和5例梅毒特异性抗体阴性标本 进行TPPA检测，结果表明缓冲液A(结合液)及缓冲液B(解离液)对TPPA检测无影响。 2．对免疫球蛋白定量检测结果的影响：用商用样本稀释液、缓冲液A(结合液)及缓冲液B(解 均值。结果表明，在仪器检测线性范围内，不同稀释液不影响IMMAGE定量检测IgG的结果。 二、蛋白G吸附及解离IgG的条件