动物病毒细胞增殖的研究进展.docVIP

动物病毒细胞增殖的研究进展 1 合适的宿主细胞 病毒适应细胞的能力与病毒自然宿主、病毒原发器官和细胞类型有关。例如，鸭肝炎病毒不能感染哺乳动物单层细胞；水貂流行性腹泻冠状病毒仅在貂肺细胞培养繁殖；马传染性贫血病毒常用马胚肾细胞系培养。SARS病毒注射到鸡、火鸡、鹅、鸭和鹌鹑胚的尿囊腔中病毒不复制，不引起病变。 猪伪狂犬病毒虽然具有广泛的嗜性，能在多种细胞内繁殖，但敏感度不同，其中以兔肾细胞和猪肾细胞(原代和传代细胞系)最适于病毒的增殖，在PK15(猪源)、Vem(猴源)、BHK(鼠源)、CEF(鸡源)细胞中，该病毒在PK15上增殖速度最快。 Coria等用鸡传染性支气管炎病毒Beaudene株接种猫、狗、绵羊、鹅等14种非宿主动物肾细胞发现，培养的病毒滴度要远远低于接种鸡胚肾细胞的病毒滴度。其中，在猫、狗、猪的肾细胞内采用直接荧光抗体方法检测不到病毒。Lukert等通过比较在鸡胚、原代鸡胚肾细胞、肝细胞上感染鸡传染性支气管炎病毒的增殖情况发现，病毒在鸡胚上的敏感度最高，是肾细胞的12～40倍，肝细胞的500～1000倍。鸡气管环上皮细胞对该病毒更敏感、更容易适应，鸡传染性支气管炎病毒肾变型分离株能够较容易的适应鸡胚肾细胞。这些也提示我们，选择病毒原发宿主细胞培养病毒更容易成功并获得较高的病毒含量。 2 连续在细胞上传代 不同种类病毒，甚至同种病毒不同株在细胞上的适应及增殖能力均不相同。具体传代次数通常与病毒和细胞种类有关。细胞类型和相应的细胞受体决定病毒是否能够感染细胞。如果细胞上表达有病毒能够识别的相应受体，病毒易侵染细胞并繁殖释放子代病毒。如天花疫苗Dryvax株经MRC25人胚肺二倍体细胞传至5代，肾综合征出血热病毒沙鼠肾细胞适应株在Vero细胞传至3～4代病毒即可稳定增殖。但是，如果细胞缺乏病毒能够识别的受体，病毒无法在细胞上适应、繁殖。通过增加病毒在细胞上的传代次数，在少量突变产生的选择作用和突变产生的重组作用下，会使病毒逐渐适应细胞，病毒滴度逐渐提高。如狂犬病毒在vero细胞上需要培养17代以上，猪细小病毒在ST细胞上培养30代，猪流行性腹泻病毒在Vero细胞上传至25代以后，病毒才逐渐适应细胞，病毒增殖趋于稳定。这种连续传代对病毒和细胞起着选择性压力作用，通过细胞传代培养，人们筛选出适应细胞生长的病毒。 3 分步适应 病毒适应细胞存在“阶段性”适应特点。初次分离的野毒株通常难以在细胞上培养生长。如果将初次分离的鸡传染性法氏囊病病毒直接接种鸡胚细胞，病毒很难适应，不能产生明显的细胞病变。若将该病毒在鸡胚上连续传代后，再接种鸡胚细胞，则较易适应鸡胚细胞培养。将鸡传染性法氏囊病病毒B87株鸡胚成纤维细胞适应毒在Vero细胞连续传4代后，出现稳定的细胞病变。同样，人工分离培养鸡传染性支气管炎病毒，需要先使病毒适应鸡胚、再适应鸡胚原代细胞、最后适应传代细胞。鸡传染性支气管炎病毒分离株在鸡胚上传代次数较低(7代)时很难在鸡胚肾细胞上增殖，而在鸡胚上适应14代后再接种鸡胚肾细胞，仅传3代后可见细胞病变。Coria等报道鸡传染性支气管炎病毒适应鸡胚后很难直接适应Vero细胞，若病毒适应鸡胚肾细胞后，在Vero细胞上生长的可能性大大提高。Cunningham等通过将鸡传染性支气管炎病毒在鼠脑进行适应性传代，之后接种Vero细胞传代，病毒在Vero细胞上获得适应。已适应鸡胚肾细胞的鸡传染性支气管炎病毒，在Marc145细胞上传至10代，可观察到明显的细胞病变。 4 病毒培养条件 在病毒适应细胞的培养过程中，对培养条件的要求也各不相同。例如培养温度、细胞培养液的pH值，甚至病毒接种细胞的方式。 接毒后细胞培养液的pH值和培养温度是影响病毒增殖的主要因素。在有囊膜的病毒中，病毒的囊膜与细胞膜发生膜融合之后，病毒侵入细胞。这种膜融合需要在特定的pH值、温度条件下受体诱发病毒囊膜蛋白构象发生不可逆的改变，从而使病毒获得进入宿主细胞的能力。例如，在pH中性或偏碱的条件下，有利于鼠、牛冠状病毒和鸡传染性支气管炎病毒与细胞发生膜融合。而流感病毒、HIV需要在低pH值下与细胞发生膜融合，进而侵入宿主细胞。近来，Akxander等发现，虽然鸡传染性支气管炎病毒在碱性条件下释放病毒粒子的速度快，但是病毒滴度下降也快。而在酸性条件下，病毒粒子释放的慢，但是病毒滴度高，病毒增殖稳定。Chu等试验发现，在pH5.0的条件下，病毒与细胞发生膜融合的速度更快，更适于鸡传染性支气管炎病毒的S蛋白与细胞膜上受体结合。 大多数动物病毒在细胞上的培养温度为37℃左右。但是，张立等发现鸡传染性法氏囊病病毒在鸡胚细胞上培养的最适温度是39℃，更接近自然宿主鸡的温度——40℃。即使同种病毒不同毒株最适培养