动物细胞的培养.docVIP

动物细胞的培养、冻存与复苏 ??? 1．熟悉细胞培养过程中的无菌操作技术。 ??? 2．了解细胞原代培养和传代培养的基本方法和主要操作步骤。 ??? 3．了解体外培养细胞的液氮冻存与复苏技术。 【实验原理】 ??? 细胞培养(cellculture)是指从机体内取出某种组织或细胞，模拟机体内的生理条件使其在体外生存、生长和繁殖的过程。细胞的体外培养在细胞生物学和医学研究领域有着极为广泛的用途，这一技术已成为研究细胞生理、细胞增殖、细胞遗传、细胞癌变和细胞工程等课题的一项不可缺少的手段。细胞培养技术的突出优点在于能为研究者提供大量的生物性状相同的细胞作为研究对象，便于人们在体外利用各种不同的方法从不同的角度研究细胞生命活动的规律。另外，利用细胞培养技术还可使人们较为方便地研究各种物理、化学和生物因素对细胞结构和功能的影响。 ??? 细胞培养可分为原代培养和传代培养2种情况。所谓原代培养(primary culture)是指直接从机体取出组织或细胞后所进行的首次培养。而传代培养(subculture)是指当原代培养的细胞增殖到一定密度后，将其从原培养容器中取出，以1：2或其他比例转移到另一个或几个容器中所进行的再培养。传代培养 可简称传代。在体外培养过程中，要使细胞能正常地生长、繁殖，需经常对其进行传代。传代的累积次数就是细胞的代数。 ??? 在从事细胞培养工作时常常会接触到细胞系(cell line)和细胞株(cell strain)这两个容易混淆的概念。一般认为，细胞系指通过原代培养并经传代后所形成的细胞群体，由于细胞系来源于原代培养，而原代培养物中所含的细胞种类较多，故一个细胞系往往由多个生物学性状不同的细胞群体所组成；而细胞 株是利用单细胞分离培养法或克隆形成法从原代培养物或细胞系中选择出的细胞群体，一个细胞株往往具有特殊的生物学性状或标记并可持续存在。 ??? 细胞培养是一种程序复杂、条件较多且要求严格的实验性工作。由于细胞在体外的生长、繁殖会受到温度、营养物质、酸碱度、渗透压及微生物等多种因素的显著影响，故细胞培养工作的各个环节如培养器皿清洗消毒、营养液配制和除菌、pH值调整、温度调节等操作都有严格的要求和规定，特别要注意无菌操作，这是细胞体外培养成败的关键。 【器材与试剂】 1．器材：恒温培养箱、超净工作台、恒温水浴箱、普通离心机、倒置相差显微镜、真空泵、电热高压蒸汽消毒锅、解剖剪、眼科剪、解剖镊、培养瓶(15m1或25m1)、表面皿、培养皿、吸管、玻璃除菌滤器(G5或G6)、小烧杯、离心杯、青霉素小瓶、血球计数板、吸管橡皮头、橡皮瓶塞、酒精灯、试管架、记号笔、75％酒精棉球、口罩、袖套。 2．材料：新生乳鼠。 3．试剂：1640培养液(含20％小牛血清)、0.25％胰蛋白酶液、磷酸缓冲液(PBS)、小牛血清、青霉素、75％酒精、5％NaHCO3液、0.85％NaCl液、三蒸水或双蒸水、二甲亚砜(DMSO)、丙三醇(甘油)。??? 4．试剂的配制： ??? (1)1640培养液：用天平称取RPMI—1640培养基粉剂若干克(依实验所需培养液的总量而定)倒人烧杯中，按说明书要求加入三蒸水、NaHCO3、谷氨酰胺，利用磁力搅拌器使加入的固体物完全溶解，然后加入适量浓度为20000单位／ml的青霉素和链霉素，使培养液中这两种抗菌素的浓度分别达到100单位／ml。再按比例加入小牛血清，使其在培养液中的含量达到20％，将溶液充分混匀，用5％的NaHCO3和1mol/L的HCl调培养液的pH值至7.0～7.1。最后用G5或G6型玻璃除菌滤器负压抽滤除菌。 ??? (2)PBS(不含钙镁，pH7.2)：分别称取NaCl 8.00g、KCl 0．20g、Na2HPO4 1.15g、KH2O4 0.20g，加三蒸水溶解并定容至1000ml。 ??? (3)D—Hanks液： ??? D—Hanks原液：分别称取NaCl80.0g、Na2HPO4·2H2O 0.6g、KCl4.0g、KH2P040.6g、NaHC03 3.5g，加三蒸水溶解至1000ml。 ??? 配制时要注意按了顷序逐一加入溶解，应等前一种药品完全溶解后再加下一种药品，原液配好后应分装于250mi或500ml玻璃瓶中，高压灭菌，置冰箱内贮存。 ??? D—Hanks工作液：取D—Hanks原液100ml，加三蒸水896ml，再加0.5％的酚红溶液4ml，混合均匀即成。 ??? (4)0.25％胰蛋白酶(pH7.2—7.6)：称取活性为1：250的胰蛋白粉剂0.25g，另准备D—Hanks工作液100ml。先用少量D—Hanks工作液将胰蛋白酶粉调成糊状，再将剩余的D—Hanks工作液全部加入，充分搅拌使酶充分溶解，必要时可将容器置于36恒温水浴箱中，直至酶液清亮，再用