肺泡巨噬细胞的制备及RNA提取.docVIP

PAM (肺泡巨噬细胞) 的制备 准备工作 高压灭菌好的1×PBS两瓶（1000ml/瓶）、小托盘1个、500ml烧杯2个、大剪刀1把、镊子2把和50ml离心管若干。另需准备好解剖小猪用的手术刀片、棉线等。 细胞培养液的配备 生长液：10%胎牛血清+DMEM培养基+双抗+两性霉素 制备细胞 将小猪腋下放血致死 从颈部剖开腹腔，避免伤到气管和肺脏 用棉线结扎气管上部，然后剪断气管，将气管和肺脏完整取出来，放到准备好的大烧杯中 转移到细胞培养室，用PBS冲洗干净肺脏表面，弃除杂物 在操作工作台上用灭菌好的剪刀剪断结扎了的气管。（以下步骤需无菌操作） 吸取PBS灌进肺内，充盈后，用手轻轻捏揉肺叶数次后，把肺内液体倒出到蓝盖瓶中。 重复灌洗2次 将所收集的液体分装到50ml离心管中，4℃2000g、10min离心 视情况可以将沉淀细胞再用PBS或培养基清洗离心1次 10、在细胞沉淀中，加入2ml Trizol试剂，用移液器充分吹打、混匀，直到形成清亮不粘稠的液体（表明细胞被充分溶解，基因组DNA被充分打断）。 后续可按Trizol试剂的标准操作抽提总RNA。也可以把此Trizol试剂保存在冰箱中保存。 RNA抽提 第二阶段：分离阶段 6．加入0. 2 ml 氯仿,剧烈混匀20 s ,室温放置10 min 。 7．10 000 rpm/min ,4 ℃离心15 min。 第三阶段：RNA的沉淀 8．吸取上清于5 ml 离心管中,加入0.5mL异丙醇（预冷）颠倒混匀5 次,室温放置10 min 。 (注意：在吸取上清时，切不可将上清与酚交界处的蛋白及下面的酚吸起，造成RNA的污染) 9．10 000 rpm/min ,4 ℃离心10min。（RNA沉淀在离心后形成胶质片状沉淀附着于试管壁） 第四阶段：RNA的漂洗 10．去上清,沉淀用1ml 75 %乙醇漂洗，振荡，7 000 rpm/min ,4 ℃离心10 min，倒净乙醇。 11．RNA 沉淀加入0.5 ml无水乙醇漂洗，振荡，7 000 rpm/min ,4 ℃离心5 min，倒净无水乙醇。（缩短RNA沉淀晾干的时间，避免RNA在空气中暴露时间过长而增加外源性Rnase对RNA的降解） 第五阶段：RNA的再溶解 12．在超净工作台上平放离心管,待离心管管壁无明显液滴时加入50 μl DEPC 处理的灭菌双蒸水，在55-600C温育10min，溶解RNA 沉淀。 13．将溶解充分的RNA溶液转移到1.5ml离心管中，做好标签，放入-800C的冰箱中保存备用。 总RNA检测及浓度测定 总RNA的完整性可通过普通琼脂糖凝胶电泳检测，过程如下： 1. 制备1.2％琼脂糖凝胶：将1.2g琼脂糖溶于1×TAE中，稍加冷却，加入少许EB，混合均匀后，灌制凝胶，待凝胶凝固好后，即可使用。 2. 点样：取2μL总RNA与2μL Gel Loading Buffer及6μL DEPC水混合后点于点样孔中，15V/cm，电泳20min。 3. 拍照：电泳结束后，用紫外透射仪观察，并用凝胶成像系统成像。 4. 用紫外分光光度计测量总RNA样品浓度，每个3次，取平均值。 5. 根据所测浓度，用DEPC水稀释每个RNA样品浓度至1μg/μL，其余样品保存在超低温冰箱备用。 总RNA反转录 根据TIANGEN TIANScript RT Kit cDNA 第一链合成试剂盒，其操作步骤如下： 1) 在冰浴的无核酸酶的离心管中加入如下反应混合物：1－5μg总RNA，2μL oligo(dT)15 , 2μLdNTP(2.5mM each),补RNase-free ddH2O定容至13.5 μL。 2) 70℃加热5分钟后迅速在冰上冷却2分钟，简短离心收集反应液后加入一下各组分：4μL 5×First-Strand Buffer,1μL 0.1 M DTT,0.5μL RNasin. 3) 加1μL（200U）TIANScript M-MLV,轻轻用移液器混匀。 4）42℃温浴50分钟。 5）95℃加热5分钟终止反应，以看家基因（GAPDH）引物扩增，验证反转录是否成功，将反转录产物置于-20℃保存备用。