马铃薯Y病毒的提纯与抗血清的制备.docVIP

马铃薯Y病毒（PVY）的提纯与抗血清的制备 陈德鑫 王凤龙 钱玉梅 （中国农业科学院烟草研究所 中国烟草总公司青州烟草研究所 山东青州 262500） 李明福 （国家出入境检疫检验局植物检疫实验所 北京100024） 摘 要 马铃薯Y病毒是一种较常见的马铃薯病毒。选用心叶烟作繁殖寄主，接种后采集病叶，采用聚乙二醇沉淀，差速离心和10--40%蔗糖密度梯度离心，得到提纯的马铃薯Y病毒，将纯化的PVY采用多种途径免疫家兔获得抗血清，琼脂双扩散测定效价。 关键词： 马铃薯Y病毒（PVY） 提纯 抗血清制备 效价 马铃薯 Y病毒（Potato Virus Y Potyvirus）(PVY)广泛分布于世界各地，严重地威胁着农业生产。近年来，马铃薯Y病毒病在全国已经发展成为比较严重的浸染性病害。 一般认为，PVY是目前危害烟草最严重的病害之一，引起产量降低，品质下降。PVYO和PVYC可能造成烟草的绝收。在与其它病毒混合侵染时PVY一般更具毁灭性，产生皱缩花叶病。 利用抗血清对PVY病毒进行检测，有利于快速诊断，为马铃薯Y病毒病的防治提供 依据。本研究的最终目的就是要获得高效价抗血清，来实现这一目的。 1材料与方法： 1.1材料 用健康的心叶烟做繁毒寄主，在4叶期采用汁液磨檫接种法。置隔离温室中观察接种叶和上位叶的发病情况。健康家兔一只，供制备抗血清用。 1.2方法 1.2.1主要溶液的配制： 0．5M磷酸缓冲液 K2HPO4/KH2PO4 (PH7.2) 缓冲液 1M 尿素 0．5M K2HPO4 0．5M KH2PO4 A液：称取0.5M K2HPO4加入1000毫升双蒸水中溶解 B液：称取0.5M KH2PO4加入1000毫升双蒸水中溶解 取一定量的A、B液混合，调节其PH至7.2，按调好的体积加入1M 尿素溶解，即配好了该缓冲液。 0.2M磷酸 缓冲液K2HPO4/ KH2PO4（PH7.4） 1M 尿素 0．2M K2HPO4 0．2M KH2PO4 A液：称取0.2M的K2HPO4加入1000毫升双蒸水中溶解。 B液：称取0.2M的KH2PO4加入1000毫升双蒸水中溶解。 取适量的A液和B液混合，调其PH为7.4，同时加入1M尿素，0.5mM 的EDTA，这样就制成了缓冲液。 （3）蔗糖密度梯度溶液： 配制10%、20%、30%、40%蔗糖溶液。 分别称取3.00g,6.00g,9.00g,12.00g蔗糖溶解在30ml双蒸水中，溶解后过滤。 （4）琼脂糖配制： 0.8%的 琼脂糖+0.85%NaCl+0.5%SDS(十二烷机基磺酸钠) 分别称取0.8g琼脂糖，0.85g的NaCl,0.5g的SDS溶解在100ml双蒸水中。 1.2.2病毒的提纯： 1.2．2．1接种毒源 将保存在活体心叶烟上的PVY毒源接种到叶龄为3—4片真叶的心叶烟上，接种后立即用水冲洗接种叶，之后置于光照、温室度适宜的隔离温室中生长。两周后采集症状明显的病叶准备提纯。 1.2．2．2 PVY的提纯 ↓一定量的感病叶片+2倍重量体积的0．2M 磷酸钾K2HPO4/KH2PO4 （PH7.4）缓冲液+1%巯基乙醇 ↓捣碎，过滤 ↓加10%体积的正丁醇于滤液中 ↓8000rpm离心30分钟，得上清即初提液 ↓加4%PEG6000，0.25MNaCl搅拌2小时 ↓静置3小时 ↓8000rpm离心30分钟，弃上清，得沉淀 ↓用0.2M磷酸钾K2HPO4/KH2PO4（PH7.4）缓冲液（10/100ml初提液）悬浮 1小时 ↓10，000rpm离心15分钟 ↓弃沉淀，得上清 ↓加1mlTriton100，混匀，上清在30%的PVY用蔗糖液（1厘米高）上 ↓38，000rpm离心1.5小时，弃上清 ↓用1ml/100ml初提液的0.2M磷酸钾K2HPO4/KH2PO4（PH7.4）缓冲液 悬浮 沉淀，搅拌过夜 ↓10，000rpm离心10分钟，弃去沉淀，上清即为纯化的病毒制剂 ↓采用蔗糖密度梯度进一步离心38，000rpm，1.5小时 ↓得到精提纯的病毒制剂 1.2.2.3紫外吸收测定： 取少量精提纯病毒，稀释20倍后，