不同能量超声及微泡对基因与组织作用的实验研究.pdfVIP

25．不同能量超声及微泡对基因和组织作用的实验研究 重庆医科大学超声影像学研究所重庆医科大学附属第二医院超声科(40(Ⅺ10) 张群霞王志刚冉海涛李晓东郑元叉景香香 超声破坏微泡进行基因转染作为一种新的基因转染方法，由于其简便、安全、有效等优点越来越受 到人们的重视。超声破坏微泡促进基因转染的机制主要为空化效应，空化效应的产生休克波，在低辐照 时能明显增强细胞膜的通透性，而在较高的辐照时则对细胞产生损伤。而空化效应对体外基因的作用尚 无研究。本文就超声及微泡对质粒DNA的作用作一简要研究，并探讨不同能量超声破坏微泡对局部小 鼠骨骼肌组织的作用。 材料和方法 质粒用琼脂糖凝胶电泳进行鉴定。体外超声对基因作用：UGTl025型超声基因转染仪(重庆医科大学超 声影像学研究所研制)，超声能量为0．25 蛋白微泡造影剂，造影剂浓度为8．3×108个／ml，微泡大小为2．7 4-O．8trift，将上述所得的质粒溶液稀释 lO倍后与微泡造影剂以5：1的体积比混合半小时，96孔的培养板，于4孔中分别加入12ul质粒溶液与 钟，另4iL中分别加入10ul稀释后的质粒溶液，用上述的超声能量作用于各板底部2分钟。 EB 5n∥ml 电泳：取琼脂糖0．59，加50HdTAE溶液，经高温溶化后，冷至60℃左右时．加2．5wl 溶液，混匀后制胶板。然后取超声作用后的质粒及质粒微泡混合物缸l加入样品缓冲溶液l出，共7／11加 入孔穴中，以TAE溶液为电泳缓冲液，在96V电压下电泳约45分钟。用凝胶成像系统对电泳结果成 像，并用凝胶分析系统对电泳后光密度进行分析。 体内实验：将12只昆明小白鼠用固定，从小鼠尾静脉输人上述的微泡造影剂0．3ml，同时用上述的 基因转染仪采用o．5W／cm2、1．0 时间为2分钟。半小时后处死小鼠，取作用局部的骨骼肌用甲醛固定，HE染色观察组织显微结构的变 7 化。 结 果 一、质粒电泳结果：不同能量的超声对质粒基因作用后，GFP质粒的电泳图谱无明显改变，不同能 量超声作用后的电泳图谱与的单纯质粒DNA比较，迁移率无改变，电泳条带仍以超螺旋DNA为主，超 螺旋DNA在同一泳道中的光密度含量无明显改变。超声破坏携基因的微泡后对基因的电泳图谱也无明 显影响，质粒的电泳结果仍以超螺旋DNA为主。 二、骨骼肌组织HE染色病理结果：O．5 W／cm2超声破坏微泡后无血管充血及红细胞渗出、1．0W／ cm2超声破坏微泡后可引起约30％血管充血，极少量红细胞渗出，2．0W／cm2超声破坏微泡后可引起约 60％血管充血，红细胞渗出较明显。2．5 W／cm2的超声破坏微泡后可损伤组织。 讨 论 基因治疗是治疗领域的瓤发展。基因治疗的方法近年来有较多的改进。而超声破坏微泡促进基因转 染的方法为各种疾病的基因治疗开辟了一条新路。研究发现用超声破坏微泡可使基因的转染率大大提 高。凌智瑜等在缺血大鼠的心肌中用超声破坏微泡的方法实现了VEGF基因的表达。大多学者热认为此 为空化效应的结果。冉海涛等研究超声空化作用对体外培养细胞缅胞旗的生物学效应，发现超声破坏微 泡所产生的空化效应使细胞膜上出现可逆性小孔，致细胞膜的通透性增高。空化效应瞬间产生的“休克 波”(shock。“e)使细胞膜表面出现可逆性小孔，提高了细胞膜的通透性，外源基因因此能较容易地经 细胞膜上的小孔进入细胞内，从而增强外源基因豹摄取、转染和表达。空化效应可促进基因表达，但l司 时亦能产生最有害的非治疗性的生物效应。高强度的压力波能使血细胞和组织破裂，并能促使空腔、气 泡的形成及加强其振荡。正是这些空化微泡造成人体组织的溶血、出血及DNA裂解。Daleck