DGGE技术及其在瘤胃微生物多样性研究应用.pdfVIP

!望塑些堡垒!竺堡全笙兰苎I互叠刁口巨巨EI ：曼三： DGGE技术及其在瘤胃微生物多样性研究中的应用 奚晓琦1一，王加启·．卜登攀1，栾广春-．2，于萍-，刘开朗1，魏宏阳·，周凌云· (1．中国农业科学院北京畜牧兽医研究所，国家动物营养重点实验室，北京100193； 2．东北农业大学动物科技学院，哈尔滨 150030) 摘要：基于可靠性强、重现性高、方便快捷等优点，变性梯度凝胶电泳(denaturinggmdientgel 技术已经成为微生物群落多样性和动态分析的强有力工具。本文在阐述PCR—DGGE原理及流程的的基础上．对 DGGE技术在瘤胃微生物多样性研究中的具体应用及其局限性与改进方法进行了全面阐述。 关键词：变性梯度凝胶电泳：瘤胃微生物多样性 反刍动物自身不具备分解纤维类物质的能力．因此． 胺1聚丙烯酰胺凝胶中进行电泳时．因其解链的速度和 瘤胃微生物作为反刍动物与日粮之间的联结纽带．在 程度与其序列密切相关．所以当某一双链DNA序列迁 反刍动物消化吸收的研究中具有重要的生理意义。在 移到变性凝胶的一定位置．并达到其解链温度时．即开 瘤胃微生物生态研究中．准确地分析测定微生物群体的 始部分解链。部分解链的DNA分子的迁移速度随解链 类型和数量．有益于揭开瘤胃消化代谢体系作用机理． 程度增大而减小．从而使具有不同序列的DNA片段滞 进而通过人工调控瘤胃微生物区系组成达到调控瘤胃 留于凝胶的不同位置。结束电泳时．形成相互分开的带 功能的目的。传统的瘤胃微生物研究是通过纯培养获 谱。为了使目的序列能够完全解链．在PCR扩增目的片 得菌株后．才能对其特性进行描述。然而．瘤胃微生物生 段时．会在某引物的5’端人为设计一个高温解链区—— 长要求复杂的营养因子和严格的厌氧环境．这使得约有 60％～80％的细菌无法培养fSuauA等，1999年：Tannock基片段附加到双链的一端。由于DNA分子中的G、C GW等．2000年)。由于纯培养是研究瘤胃微生物表型碱基对要比A、T碱基对结合得牢固．因此G、C含量高 特征、细胞的性质的前提。因此这一限制使得瘤胃微生 的区域具有较高的解链温度。这样．DNA片段的原有 物特征很难被具体描述。此外．传统分析方法为微生物 部分就处在低温解链区从而可以实现更好的分离。常 进化关系的研究提供的信息很有限．而微生物进化研究 的匮乏导致难以对微生物进行精确分类。现代分子生物 段的序列变化情况，只能有50％的检出率(MyersR等， 学技术的发展使得我们可以摆脱纯培养条件的束缚。 gradient 与传统方法相比，变性梯度凝胶电泳(denaturing (MyersR等，1985年；She侬eldV等，1989年)。理论上 gelelectmphoresis，DGGE)技术能够快速、准确地鉴定认为．只要选择的电泳条件如变性剂梯度、电泳时间、 微生物种群．并进行复杂微生物群落结构演替规律、微 电压等足够精细．有一个碱基差异的DNA片段都可被 生物种群动态、基因定位、表达调控的评价分析，为探 分开。而且染色后的凝胶用成像系统分析．还可以半定 索瘤胃微生物多样性开辟了一条新思路。 量地测定样品DNA浓度的大小．反映微生物群落组成 1 DGGE技术的基本原理及其流程 的变化。该方法扩增样品的16SrRNA的部分基因序列 DGGE作为检测核酸变异和点突变的一种电泳技 术．不是基于核酸分子量的不同将DNA片段分开．而是 再同基因文库中的现有序列比较．即可确定微生物的 根据DNA序列的不同。DNA分子双螺旋结构是由氢键种类。 和碱基的疏水作用共同作用的结果．温度、有机溶剂和 2 DGGE技术的应用 pH等因素可以使氢键受到破坏。导致双链变性为单链。 而双链DNA分子中A、T碱基之间有2个氢键．而G、C突变监测(Mvers 碱基之间有3个氢键连接，因此A