丙型肝炎中P7蛋白.docVIP

丙型肝炎病毒中p7蛋白的研究 摘要：p7蛋白是一个介于丙型肝炎病毒(HCV) 结构蛋白和非结构蛋白之间的一小蛋白，在脂质膜中形成六聚体阳离子通道，在病毒的自然感染过程中起一定的作用。金刚烷胺和长烷基链的亚氨基糖衍生物可抑制p7形成的阳离子通道，从而对HCV的治疗发挥重要作用。本文就p7 蛋白的基因组结构、合成与功能作一综述。 关键字：丙型肝炎病毒；p7蛋白； 丙型肝炎病毒(hepatitis C virus , HCV) 单股正链的RNA 病毒,全长为916 kb ,包括1 个大的开放阅读框(ORF) 和两侧的5′,3′非编码区(UTRs)。核糖体通过进入HCV 5′UTR 端的内部核糖体进入位点( IRES) ,将HCV基因组翻译成1 个聚蛋白前体. 前体聚蛋白被宿主和病毒的蛋白酶共同切割成为若干个具有独立功能的HCV 蛋白,根据功能的不同分别命名为C、E1、E2、p7、NS2、NS3、NS4A、NS4B、NS5A 和NS5B ,它们不但在HCV 的生活史中发挥着重要的作用,也影响着宿主细胞的信号传导、凋亡及物质代谢等一系列生化过程. P7蛋白的基因组结构与合成 p7是一个小的疏水性多蛋白，包括36个氨基酸残基，编码基因位于结构蛋白和非结构蛋白之间，是膜相关性的，定位在内质网内。他包括2个跨膜α螺旋，与一小的带电细胞质环相连，其氨基和梭基端尾朝向细胞内质网腔。这一带电环为亲水片段，p7蛋白属于病毒孔道蛋白家族，在细胞膜内其同源寡聚体形成水相孔道，这些蛋白最具特征性的代表是流感A病毒的M2通道p7通过与谷胧甘肤—S—转移酶(GST )在大肠杆菌中的融合可获得高水平 的表达，二者之间被—6组氨(HIS)连接子所分离形成GST—HIS—p7复合结构。通过透射电子显微所成像发现，GST—HIS—p7和裂解的近于天然HIS—p7均呈具有纬度的环状结构.。化学交联数据表明p7形成五聚体或六聚体结构，Griffin et al研究表明在HepG2细胞中,重组的HCV p7可交联成六聚体，在体外大肠杆菌表达的p7亦可形成六聚体。 p7 蛋白的功能 p7 蛋白是膜定位蛋白。在 HCV 基因组中，p7是相对分子质量( Mr) 最小的病毒蛋白。研究证实，HCV 前体蛋白的加工在宿主细胞内膜系统上进行，膜的定位作用对非结构蛋白的加工成熟尤为重要[4]。非结构蛋白 C-末端通过 NS5B C-末端疏水α-螺旋定位在内质网膜上[5]，而 N- 末端则是通过 NS2与p7蛋白结合，直接被定位在内质网膜上。因此，p7 蛋白的膜定位作用很可能是非结构蛋白加工成熟的前提条件。D.Agostino 等人[6]的研究也证实, 包括p7蛋白在内的许多致瘤病毒蛋白都能与细胞内膜相互作用。p7 蛋白14区和9区α- 螺旋结构是膜定位区, 两次跨膜将 p7蛋白锚定在内质网膜上。尽管构成A- 螺旋结构的氨基酸存在广泛的变异性, 但其中个别保守氨基酸对保持跨膜结构的稳定, 起到了重要作用[7]。 15区是3 个氨基酸组成的保守环结构, 具有离子通道活性, 这种活性可被抗病毒药物金刚烷抑制[8]。Griffin 等人[9]的研究证实, 融合表达的 p7 蛋白在HepG2细胞内可以形成六聚体, 六聚体围成了离子通道, 这个离子通道是由单体中 K-G-R 3 个氨基酸的侧链基团围成。同样的结论也在人工生物膜上得到证实。 p7 蛋白还决定病毒的感染力。Sakai 等人[10]用HCV1a/2a 重组的 p7 蛋白病毒感染黑猩猩, 发现这种嵌合病毒丧失了感染性, 因此推测, p7 蛋白在病毒的感染过程中可能与基因组的其他区域发生了特异性作用, 包括 5’-UTR 以及 C、E、NS2 等蛋白。对KGR 基序中的碱性氨基酸突变表明, 突变将导致病毒丧失感染能力。与 HCV 同属的 BVDV 病毒的 p7蛋白研究也发现, p7 蛋白与病毒 RNA 的复制没有相关性, 但用细胞培养系统进行病毒扩增时, p7 蛋白却是不可缺少的[8]。这些现象都说明, p7 蛋白不影响 HCV 基因组的复制, 但参与了 HCV 感染细胞的过程。 丙型肝炎病毒P7 蛋白体外原核表达状况 设计扩增全长HCVP7 基因片段的特异引物，以H/FL 质粒DNA（含HCV1acDNA全长序列）为模板，通过PCR 扩增全长HCVP7 基因，定向克隆到pQE30、pGEX4T- 2、pET32a（+）3 种不同类型的原核表达载体中。将重组后包含HCVP7 基因的原核表达载体转化表达型大肠杆菌BL21（DE3）pLysS 或SG13009（PREP4），并做异丙基硫化-β- D- 半乳糖苷（Isopropyl- beta- D- thiogalactoside，IPTG）诱导表达，通过SDS- PA