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新技术在毒理学中的应用 08级食品质量与安全（3）班 戴黛摘要：近20年来，毒理学领域发生前所未有的巨大进展，而这些进展的取得，在很大程度上得益于科学新思想的渗透和新技术的应用。特别是细胞生物学和分子生物学理论和技术的飞速发展，PCR技术、核酸杂交技术、DNA测序技术以及一系列突变检测技术已广泛应用于外源化合物和环境致癌物引起的DNA损伤、基因突变、加合物形成及癌基因和抑癌基因研究等方面。特别是近年来基因差异分析技术、转基因技术、基因芯片技术等分子生物学新技术的建立和引入，大大提高了毒理学研究的整体水平。 关键字：毒理学 细胞生物学 分子生物学 正文： “民以食为天”，饮食是人类社会生存发展的第一需要。现在，人们已经把食品的安全性作为食用的重要原则和取舍标准。可是，近年来，因为食品污染造成的急性食物中毒事件越来越多，随着食品的数量和种类日益丰富，如何提高食品的质量和安全性已经成为了社会公众普遍关注的问题。 毒理学就是研究外源化合物对生命机体损伤作用及机制的一门科学。所谓外源化合物是指存在于人类生活的外界环境中，可能与机体接触并进入机体，在体内呈现一定生物学作用的化学物质。主要有人类在食品生产、加工中使用的物质和食物本身生长中存在的物质。 外环境中的多种有害因子，包括物理因子、化学因子和生物因子等，通过不同途径作用于机体，引起机体的器官组织结构和功能的改变，而这些改变都是要通过细胞结构与功能的变化反映出来的。因此，细胞毒理学研究是用细胞进行毒理学研究，应用体外培养模型对环境有害因子进行检测，评价其对人体可能产生的危害。 分子生物学水平上毒理学则是在毒理学发展过程中，受到分子生物学理论和技术促进而发展起来的，从分子水平上研究外源化合物与生物机体相互作用的一门学科。它要不仅探讨众多的外源化合物对生物机体组织中的各种分子，特别是生物大分子的作用机制，从而阐明外源化合物的分子结构与其毒效应的相互关系，还要从分子水平上表述生物体对外源化合物的效应。 下面主要列举细胞生物学和分子生物学水平上的六大类新技术在毒理学方面的应用。 一、PCR-SSCP 技术 PCR技术称聚合酶链反应技术，又称无细胞克隆技术，是一种对特定的DNA 片段在体外进行快速扩增的新方法。其主要过程由变性、退火和延伸三个步骤反复的循环组成。在高温下，待扩增的DNA 双链受热变性，成为两条单链DNA 模板；而后在较低温度条件下，两条人工合成的寡核苷酸引物与互补的单链DNA 模板结合，形成部分双链；再在高温条件下，通过DNA 聚合酶作用，以引物3/端为合成起点，单核苷酸为原料，沿模板以5/?ú3/方向延伸，合成DNA 新链。这样，每一双链的DNA模板经过一次解链、退火和延伸三个步骤的热循环后就形成两条双链DNA分子 PCR-SSCP 分析的主要优点是简易且敏感性较高。但该技术不能确定基因变异的类型和部位。其检测敏感性随PCR 产物长度的增加而降低。 二、SCGE 技术 真核细胞的DNA 相对分子质量很高且具有严密的超螺旋结构。在理想条件下，正常对照组细胞DNA 在电泳之后保持在原来位置。当细胞DNA 受损伤产生链断裂时，DNA 的超螺旋结构受到破坏；在细胞裂解液作用下，细胞膜、核膜及其它膜结构受到破坏，细胞内的蛋白质、RNA 及其它成分均可进入凝胶而扩散到裂解液中，而核DNA 相对分子质量很高不能进入凝胶，只能留在原位。在碱处理和碱性电泳液的作用下DNA 解螺旋，使DNA 的断链和碱易变性DNA片断从严密的超螺旋结构中释放出来；由于这些DNA 断链相对分子质量较小且碱变性为单链，所以在电泳电场中就可以离开核DNA 向阳极移动，形成彗星状图像，用荧光染料染色就可观察至彗星状细胞核，拖尾的长度体现了DNA 损伤程度。DNA 受损伤越严重，产生的断链和碱易变性片断就越多，断链也越小，在相同电泳条件下迁移的DNA 量就越多，迁移的距离就越长 SCEG技术主要的应用有DNA 的损伤与修复、DNA-蛋白交联、遗传毒性评价。 三、基因差异分析技术 研究基因差异表达主要技术有消减文库筛选、差异杂交、mRNA 差异显示、代表性差异分析、基因表达系列分析和电子消减等技术。其中mRNA 差异显示和代表性差异表达分析是基于PCR 技术，很灵敏的检测差异表达基因的方法。1992 年，Liang 等根据高等生物成熟的mRNA 带有polyA 的特性，用特异的锚定引物反转录后，进行扩增，建立了mRNA 差异显示技术，成为一种筛选和克隆新基因的方法。mRNA DD 如同蛋白质双向电泳，都是研究基因的表达产物，但mRNA DD 对基因表达的微量产物可以扩增放大，这是蛋白质双向电泳无法比拟的。 mRNA DD 在分离、筛选和鉴定差异表达的基因方面具有广泛的应用前景，已应用于农业、植物、动物、医