真核表达载体pIRES2-EGFP-PELP1的构建和其在人牙周膜干细胞中的表达.pdfVIP

史堡旦壁医堂苤盍垫!!生!旦箜塑鲞缝王!|!g!也!!!里!丛，垒!匙墅!!!!：y!!：塑：!12P!：! ．牙周病学研究 真核表达载体pIRES2一EGFP—PELPl的构建 及其在人牙周膜干细胞中的表达 严妍牛忠英 汤楚华 史亮 司少艳 宋淑军 【摘要】 目的克隆人源脯氨酸-谷氨酸一亮氨酸富集蛋白1(proline一，glutanicacid一，leucine—rich proteinl，PELPl)基因全长，构建PELPI基因全长过表达载体，研究PELPl基因表达特点，为PELPl基 因在不同组织细胞中的功能性研究奠定基础。方法 采用反转录PCR法从MCF一7细胞总RNA中 克隆PELPl基因全长，与含有EcoRI与Xho I双酶切位点的真核过表达载体pinES2一EGFP质粒载 体连接，构建重组质粒pIRES2一EGFP—PELPl。经双酶切及测序鉴定重组质粒中PELPl基因的完整性 及正确性。运用脂质体将重组质粒转染至人牙周膜干细胞中，运用实时定量PCR(quantitative real—time PCR，qRT—PCR)及蛋白质印迹法分别从基因和蛋白水平对转染细胞中PELPl的表达进行检 测。结果 成功克隆出PELPl基因全长，并将其插入至pIRES2一EGFP过表达载体中，经双酶切鉴定 和测序鉴定证实目的质粒片段插入无误。重组质粒plRES2．EGFP．PELPl转染48h后PELPl基因水 平是转染空质粒人牙周膜干细胞的(148．0±1．3)倍，二者差异有统计学意义(P0．005)。蛋白质 印迹法结果显示，与转入pIRES2一EGFP的人牙周膜干细胞中PELPI蛋白相对表达量(0．3300± 0．0117)相比，转入plRES2一EGFP—PELPl重组质粒的人牙周膜干细胞中PELPl蛋白相对表达量 (0．6200±0．0045)显著增高，二者差异有统计学意义(P0．005)。结论本项研究成功运用 qRT—PCR反应从MCF-7细胞中克隆出PELPl全长基因，并成功构建pIRES2一EGFP—PELPl真核过表 达载体。 【关键词】牙周膜； 干细胞；基因克隆；载体 Constructionof vectorandits inhuman pIRES2-EGFP-PELPleukaryoticexpression expression stemcells YAN periodontalligament Yan’，NlU Chu—hua，SHl Zhong—ying，TANG Liang．SIShao—yan． SO蕊G CenleFOral 306th Liberation Diseases．The Shu-jun．’Treatmentof HospitatofPeople’s Army，Be诳ng 100101．China author：MU Corresponding Zhong—ring，Entail：shishengen@sohu．COm．孔f：0086—10 Toconstructan full ofPELPl 【Abstract】Objective over—expressingplasmidcontaininglength and the of characterizationPELPl indifferenttissues．MethodsFull gene investigate expressions 1ength PELPlwascloned RT-PCR ofMCF-7 RNAas total the PELPl gene