细粒棘球蚴中国大陆株诊断抗原P-29基因的克隆与序列分析.pdfVIP

维普资讯 第29卷 4期 宁夏医学院学报 2007年 8月 JoumalofNingxiaMedicalCollege ·337 · 文章编号 ：1005—8486(2007)04—0,337—03 · 论著 · 细粒棘球蚴中国大陆株诊断抗原 P一29基因的克隆和序列分析 师志云， 王娅娜 ， 马 锐， 于晶晶， 于辛酉， 高 岭， 赵 巍 (宁夏医学院遗传学和细胞生物学教研室，银川 750004) 摘要：目的 获得细粒棘球蚴(E，granulosus)诊断抗原(diagnosticantigen)P一29基因并进行序列分析。方法 从包虫病患者体内获取细粒棘球蚴原头蚴提取总RNA，根据 GenBank公共数据库检索出细粒棘球蚴诊断抗原 P一29基因的已知序列设计一对引物，通过 RT—PCR技术扩增出细粒棘球蚴中国大陆株诊断抗原 P一29基 因，将其重组到pGEM—T载体后进行序列测定和分析。结果 成功扩增出细粒棘球蚴中国大陆株诊断抗原 P一29基因，测序表明该片段由717bp组成，与已发表基因核苷酸序列相比，同源性为 100％，推导编码氨基酸 序列同源性为 100％。结论 成功克隆细粒棘球蚴中国大陆株诊断抗原P一29基因序列 ，可做为包虫病重组 抗原的候选基因。 关键词：细粒棘球蚴；诊断抗原 P一29基因；克隆；序列分析 中图分类号：R383．33 文献标识码：A 细粒棘球蚴病 (Echinococcosis)又称囊型包虫病 (Cystic 京华美公司。 echinococcosis，CE)，是由细粒棘球绦虫 (Echinococcusgranl1． 1．1．4 RT—PCR引物：通过互联网GenBank公共数据库检 1osus，Eg)幼虫引起的一种严重危害人体健康和畜牧业发展 索出细粒棘球蚴诊断抗原P一29基因序列(GenBank序列号： 的人畜共患寄生虫病。该病呈全球性分布，仅在少数地区 AF07893)，经 DNAMan分析软件设计引物：P1：5’ATGGATC． 如冰岛、爱尔兰和格陵兰未发现原发性包虫病患者…1。我 Q CTCCGG衄TIACC Ⅸ C 3’，P2： 5’GTCA~ CGCC． 国主要流行于甘肃 、新疆、青海、宁夏等西部地区，每年给家 TACT℃CcccAGC俺℃m 3’。在两条引物的端部加上保护性 畜业带来经济损失达 10亿元_2j。治疗以外科手术为主，药 碱基，为了便于亚克隆，在引物 1和引物 2的两端分别引入 物治疗为辅，尽管综合预防措施取得了部分成效，但至今还 一 个BamH]和NotI酶切位点，引物由北京赛百胜公司合成。 无一种十分理想和有效的预防手段。近年来 ，随着现代分 1．2 方法 子生物学技术在寄生虫研究中的应用 ，包虫病的免疫预防 1．2．1 细粒棘球蚴原头蚴总 RNA的提取：取新鲜或液氮 取得了重大的进展。本实验拟通过基因工程技术筛选和克 中冻存的原头蚴200mg，按试剂盒 (TotalRNAIsolationSys． 隆细粒棘球蚴中国大陆株候选基因诊断抗原 P一29基因序 tem)说明抽提总 RNA。 列，并进行序列分析，为包虫病重组疫苗候选基因的研究打 1．2．2 逆转录聚合酶链反应 (RT—PCR)：其反应组成为：5 下基础。 ×Bufferl0t,L，10MmdNTP1 ，25mM MgSO．2 ，AMV1 ，T玎 1 材料与方法 1 ，引物 1和引物2各2 ，RNA2 ，DEPC水29 。反应 1．1 材料 条件为：48℃ 45min，94oC2min；49oC 30s，60oClmin，68oC 1．1．1 细粒棘球蚴原头蚴的收集：无菌条件下抽取宁夏医 2min，40个循环；68~C7min。待反应结束后 ，将 PCR产物在