5.核酸印迹和分子杂交.ppt

* 分子生物学技术 高 颖 gaoying822@ 核酸印迹技术与分子杂交 Nucleic Acid Blotting and Molecular Hybridization 核酸分子杂交 （nucleotide molecular hybridization） 以DNA的变性、复性为理论基础； 指具有一定同源序列的两条核酸单链（DNA或RNA），在一定条件下按碱基互补配对原则经过复性处理后，形成异源双链的过程。 Southern印迹（Southern blot） 基本操作过程 待测DNA样品制备、基因探针标记； 待测DNA样品的电泳分离； 电泳分离的DNA经变性、转移、固定到合适的固相支持物； 特异性核酸探针与膜上DNA片段杂交，放射自显影或显色检测目的DNA的存在。 Southern blot基本流程 电泳 转移 杂交，显影 酶切DNA样品上样 DNA印迹 重物 Southern blot关键步骤 待测DNA样品的酶切消化 基因组DNA进行消化，才能在电泳过程 中将不同长短的DNA片段分离开。 基因探针的标记 探针序列和探针信号的选择。要考虑 特定基因的重复性、保守性和稳定性。 可用同位素和非同位素标记。 Northern 印迹（Northern blot） 是将RNA从凝胶中转印到硝酸纤维素膜上，定性分析mRNA的常用方法。 注意事项：RNA易被酶降解。 可用于分析基因转录水平的变化 。 Western blot （蛋白免疫印迹）技术 是将蛋白质从聚丙烯酰胺凝胶中转印 到化学合成膜的支撑物上，利用特异性抗体 进行反应，定性分析蛋白质。 用于分析基因表达(蛋白水平）的变化。 原位分子杂交技术 利用分子杂交技术来进行基因及其表达产物定位分析的一种技术。 组织、细胞或染色体的固定； 探针； 与探针结合的标记物； 可用于基因及其表达产物的定位分析。 聚合酶链式反应 Polymerase Chain Reaction 聚合酶链式反应 （polymerase chain reaction, PCR） 是一种在体外特异地扩增已知基因的方法； 由K. Mullis于1983年建立；1999年获诺贝尔化学奖。 可用于分析基因及其产物的水平变化； 可进行实时、定量分析； 　 PCR 体系 模板 引物 耐热DNA聚合酶 dNTPs 含Mg2+的缓冲液 　 PCR的过程 变性(Denaturing) 95℃DNA模板变性成为单链，引物自身和引物间的局部双链消除 退火(Annealing) 引物与模板DNA杂交，Tm值减5℃ 延伸(Extension) DNA聚合酶在72℃催化DNA的合成 ing PCR技术的工作原理 * PCR技术 PCR分析已知基因； 反转录PCR（reverse transcription PCR，RT-PCR）是将RNA的反转录和PCR联合应用的一种技术。 RT-PCR是从组织或细胞中获得目的基因及对已知序列的RNA进行定性及半定量分析的有效方法。 RT-PCR与PCR区别 模板为mRNA 需逆转录酶 产物为cDNA * mRNA 5? AAAAAA(n) 3? mRNA 5? AAAAAA(n) 3? TTTTTT(n) 5? mRNA 5? cDNA 3? AAAAAA(n) 3? TTTTTT(n) 5? AAAAAA(n) 3? TTTTTT(n) 5? oligo(dT)12-18 反转录酶 RNase H DNA 聚合酶 S1 核酸酶 3? cDNA TTTTTT(n) 5? AAAAAA(n) 3? TTTTTT(n) 5? 反转录合成cDNA 实时、定量PCR技术 在PCR反应体系中加入荧光基团，利用荧光信号积累实时检测整个PCR进程。通过标准曲线对样品中的DNA的起始浓度进行定量的方法。 特点：对DNA/RNA模板定量，灵敏度强，特异性高。 * 实时、定量PCR技术 Q R 3 3 5 5 上游引物 下游引物 荧光标记引物 R Q 3 3 5 5 DNA序列测定 DNA Sequencing DNA序列分析方法 双脱氧链终止法 利用2′，3 ′-双脱氧核苷酸掺入中， 终止化学反应 化学