实验七、凝胶过滤层析.ppt

实验七 凝胶过滤层析纯化细胞色素C 一、目的要求 1.学习和掌握凝胶过滤层析分离蛋白质的原理与方法。 2.通过凝胶过滤柱层析对细胞色素C进行纯化 二、原理 凝胶过滤层析也称分子筛层析、排阻层析。是利用具有网状结构的凝胶的分子筛作用，根据被分离物质的分子大小不同来进行分离。 内水体积Vi 外水体积Vo 柱床体积Vt 洗脱体积Ve Vt=Vo+Vi+Vg Ve=Vo+KdVi Kd=(Ve-Vo)/Vi Kd=0 Kd=1 0Kd1 Kd1 优点： a. 条件温和 b.操作简便 c. 损失少回收率高 d. 层析柱可反复使用 凝胶的类型： Sephadex: 交联葡聚糖 Sepharose：琼脂糖凝胶 Bio-Gel A Bio-Gel P：聚丙烯酰胺凝胶分子筛 Sephacryl：用N，N-亚甲双丙烯酰胺交联的葡聚糖凝胶 凝胶及柱的选择 样品上柱 分析用量：柱床体积的1—2% 制备用量：柱床体积的20—30% 洗脱收集 部分收集器、核酸蛋白检测仪 凝胶的保存方法 0.02%叠氮钠或0.002%洗必泰 应用 a. 分离蛋白质 b. 脱盐 c. 蛋白质分子量的测定 三、试剂与器材 试剂：0.01mol/l Tris-HCl缓冲液，PH7.5，含0.2mol/l NaCl 器材：层析柱、部分收集器、核酸蛋白质检测仪 、记录仪 四、仪器的使用－核酸蛋白检测仪及部分收集器的操作方法 核酸蛋白检测仪及记录仪操作方法 1、在仪器使用前，首先检查检测器，电源和记录仪三部份电路连接是否正确，插上电源插头。 2、接通记录仪电源开关，使电源开关拔到“通”指示灯亮。可根据需要调换不同的走纸速度。记录仪量程调在10mV档上。 3、将检测仪波长旋钮旋到所需波长刻度上，把量程旋钮拔到100％T档。 4、按下检测仪电源箱面板上的电源开关，此时记录仪指针从零点开始向右移动某一刻度，调节“光量”旋钮使指针停留在记录仪大约中间位置5mV左右数字显示为50左右。仪器开机稳定时间大约在1小时左右，待基线平直后，可加样测试。 5、把检测器进样口塑料管接到部份收集器上，使层析柱中的洗脱液通过。透光率为“0”厂家巳调好，光密度A要调零，量程开关拔到100％T，调节光量旋钮，使记录仪指针在10mV数字显示为100，即透光率为100%。把量程开关拔到“A”挡，缓慢调节A调零旋钮，使检测仪数字显示为“0” ， 同时调节记录仪零位旋纽使记录仪指示在0位 。 6、上述5个步骤结束后，就可以在层析柱上加样。当样品经层析柱分离，通过检测后，就能通过记录仪给出所需样品吸收的图谱。 7、测试完毕，必须切断电源，并用蒸馏水清洗样品池和尼龙管。 记录仪光吸收A读数 当采用l0mV量程记录仪时，记录仪的满量程读数对应于A量程开关所对应的A读数范围。如A量程开关选定在0-0.5A时，则记录仪满量程光吸收A读数为0.5，当记录笔指示在记录纸一半 (50%刻度)位置时即为0.25A。 数字显示光吸收A读数(可变量程读数模式) 当A量程开关选定在0-1.0A档时，此时数显板上显示和读数即为光吸收A的实际读数，如显示为080即表示为0.80A。 当A量程开关切换在其它量程位置时，则数显光吸收A读数为: A量程选定在0-2.0档时，数显读数×2=实际光吸收读数A A量程选定在0-1.0档肘，数显读数×1=实际光吸收读数A 部分收集器的操作方法 1．将“手/自”框内的键置于自动状态，按“定”和“停”;使定时时间为零，放开“停”按“快”或“慢”(“定”仍按着)至所需的定时时间，放开慢和“定”，再按一下停设定定时时间工作就完毕。若要查看设置时间，则只需按一下“定”键，就能显示上一次所设时间，若要以秒显示走时时刻，则需按下“秒”键。 2．定位， 将“顺/逆”键置于“顺”或“逆”状态，按“手动”键，使试管架转至终点，这时报警器工作，报警指示灯亮，然后将“顺/逆”键置于“逆”或 “顺”状态，本仪器就会自动地对准第一个试管(在 “顺”状态，第一臂试臂为最外的那根。在“逆”状态，第一臂试管为最内的那根)。如滴管口没对准第一根试管只要松开换节臂调整螺钉，使滴臂口对准第一根试管即可。 五、操作方法 （一）凝胶的选择与处理 1.凝胶及柱的选择 根据细胞色素C的分子量选择Sephadex G100。选用1.5 cm×60 cm的柱子。 2.凝胶的处理 凝胶型号选定后，将干胶颗粒悬浮于5-10倍量的蒸馏水或洗脱液中充分溶胀，溶胀之后将极细的小颗粒倾泻出去。自然溶胀费时较长，加热可使溶胀加速，即在沸水浴中将湿凝胶浆逐渐升温至近沸，1-2小时即可达到凝胶的充分胀溶。加热法既可节省时间又可消毒。 （二）装柱 1.装柱前，必须用真空