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T、B淋巴细胞分离试验 2006-12-28 00:00:00???来源：???评论：0???我要评论 淋巴细胞主要分T淋巴细胞和B淋巴细胞两大亚群，它们具有不同的特性和功能，为此在进行某些免疫学实验时，首先需分离出纯的T淋巴细胞和B淋巴细胞。本试验的原理为：淋巴细胞与用溴花二氨基异硫氢化物（简称AET）处理的绵羊红细胞（SRBC）混合后，其中全部T淋巴细胞均能吸附AET—SRBC… ? ? PCR实验交流?核酸实验交流?细胞实验交流?蛋白实验交流?免疫实验交流?生物软件交流 淋巴细胞主要分T淋巴细胞和B淋巴细胞两大亚群，它们具有不同的特性和功能，为此在进行某些免疫学实验时，首先需分离出纯的T淋巴细胞和B淋巴细胞。本试验的原理为：淋巴细胞与用溴花二氨基异硫氢化物（简称AET）处理的绵羊红细胞（SRBC）混合后，其中全部T淋巴细胞均能吸附AET—SRBC，形成牢固稳定而巨大的E—花环，较正常未处理的SRBC形成的E—花环百分比为高，而且形成快速，不易脱落，重复性好。再经淋巴细胞分层液分离时，AET—E花环易沉于管底，而未形成E—花环的T淋巴细胞，用低渗液解花环周围的AET—SRBC，便可获得纯T淋巴细胞，而B淋巴细胞可直接取自分层液的界面。材料及试剂：a)新鲜豚鼠血b)兔红细胞（RRBC）c)溴花二氨基异硫氢化物（AET）d)淋巴细胞分层液e)其它Hanks液，含小牛血清的199培养液，无菌生理盐水，3.5%氯化钠溶液，离心机等。方法：1.AET—RRBC制备（1）.AET溶液的制备称取AET粉剂402毫克，溶于10毫升蒸馏水中，使成为0.143M溶液，用4NNaOH溶液调pH9.0。该溶液必须新鲜配制，不宜久存。（2）.AET处理RRBC取洗涤好压积的RRBC，按一份压积AET—RRBC加入4份新鲜配制的pH9.0的AET溶液充分混匀置37水浴15分钟，每隔5分钟摇匀一次。取出加冷无菌生理盐水至离心管口（1—2厘米）1800转/分离心5分钟。连续洗涤3—5次，每洗一次，必须充分摇匀，以减少AET—RRBC粘附成团，并观察有无溶血。若有溶血现象，则用含小牛血清的199培养基再洗一次，最后配成10%AET—RRBC悬液，置4保存，不得超过5天。（3）.1%AET—RRBC的配制：将预先配制并保存于4冰箱的10%浓度的AET—RRBC，以含10%小牛血清的199培养液稀释至1%。2.从新鲜豚鼠血液分离单个核细胞，操作见后试验。3.AET—E花环试验：将分离的单个核细胞（2106/毫升）与等量1%AET—RRBC混合，置37水浴15分钟，每隔5分钟摇匀一次，分装数管，每管2—3毫升，低速离心（1000转/分钟）5分钟后，移至4冰箱45分钟。4.T淋巴细胞和B淋巴细胞的分离将形成E—花环的细胞悬液，再用淋巴细胞分层液分离，吸取界面云雾状的细胞，即为富含B淋巴细胞群。沉淀于管底的E—花环，用Hanks液洗一次后，加双蒸水3毫升处理3分钟，低渗裂解E—花环周围的RRBC，立即加3.5%氯化钠溶液1毫升，使还原为等渗，低速离心沉淀，即得富含T淋巴细胞群。 【摘要】：目的过敏性紫癜（HSP）是儿童期最常见的系统性小血管炎。尽管已知血管内皮损伤是HSP主要病理变化，但其血管内皮损伤机制尚不清楚。本研究通过观察HSP血清及血清IgA1刺激下人脐静脉内皮细胞（HUVECs）分泌炎性细胞因子水平及HUVECs中细胞间黏附分子-1（ICAM-1）和核因子-κB（NF-κB）相关基因及蛋白表达的变化，初步探讨儿童过敏性紫癜血清IgA1与血管内皮损伤的关系及血管内皮细胞损伤的分子机制。方法1.血清采集及IgA1的提取：本院儿科住院确诊为HSP的急性期患儿10例及10例健康体检儿童均于清晨空腹抽取外周静脉血5ml，分离血清；Jacalin亲和层析法提取血清IgA1。2.实验方法：采用体外细胞培养方法，实验分三组观察：HSP组，正常对照组，空白对照组。HSP组分别用患儿血清及患儿血清IgA1与HUVECs共培养；正常对照组分别用正常儿童血清及正常儿童血清IgA1与HUVECs共培养；空白对照组用无血清培养基与HUVECs共培养。培养12h后分别检测各组上清液炎性细胞因子水平。采用MTT比色法检测各组IgA1刺激下HUVECs吸光值，观察不同浓度IgA1刺激HUVECs增殖情况。实时荧光定量聚合酶链反应（Real time PCR）和蛋白质印记技术（Westernblot）检测IgA1刺激下HUVECs中NF-κB和ICAM-1mRNA及蛋白表达。结果1. HSP患儿血清及血清IgA1分别与HUVECs共培养12h后，HSP组上清液IL-8、TNF-α和NO水平均明显高于正常对照组和空白对照