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DNA 甲基化检测技术全攻略 近年来涌现出不少DNA 甲基化的检测技术，少说也有十几种。大致可以分为两类：特 异位点的甲基化检测和全基因组的甲基化分析，后者也称为甲基化图谱分析(methylation profiling)。下面大家介绍一些常用的方法。 特异位点的甲基化检测 甲基化特异性PCR(MS-PCR) 这种方法经济实用，无需特殊仪器，因此是目前应用最为广泛的方法。在亚硫酸氢盐 处理后，即可开展MS-PCR。在传统的MSP 方法中，通常设计两对引物，一对MSP 引物 扩增经亚硫酸氢盐处理后的DNA 模板，而另一对扩增未甲基化片段。若第一对引物能扩增 出片段，则说明该检测位点存在甲基化，若第二对引物能扩增出片段，则说明该检测位点不 存在甲基化。 这种方法灵敏度高，可用于石蜡包埋样本，且不受内切酶的限制。不过也存在一定的 缺陷，你要预先知道待测片段的DNA 序列，并设计出好的引物，这至关重要。另外，若存 在亚硫酸氢盐处理不完全的情况，那可能导致假阳性。 亚硫酸氢盐处理+测序 这种方法一度被认为是DNA 甲基化分析的金标准。它的过程如下：经过亚硫酸氢盐处 理后，用PCR 扩增目的片段，并对PCR 产物进行测序，将序列与未经处理的序列进行比 较，判断CpG 位点是否发生甲基化。这种方法可靠，且精确度高，能明确目的片段中每一 个CpG 位点的甲基化状态，但需要大量的克隆测序，过程较为繁琐、昂贵。 联合亚硫酸氢钠的限制性内切酶分析法(COBRA) DNA 样本经亚硫酸氢盐处理后，利用PCR 扩增。扩增产物纯化后用限制性内切酶 (BstUI)消化。若其识别序列中的C 发生完全甲基化(5mCG5mCG)，则PCR 扩增后保留为 CGCG，BstU I 能够识别并进行切割;若待测序列中，C 未发生甲基化，则PCR 后转变为 TGTG，BstUI 识别位点丢失，不能进行切割。这样酶切产物再经电泳分离、探针杂交、扫 描定量后即可得出原样本中甲基化的比例。 这种方法相对简单，可快速定量几个已知CpG 位点的甲基化，且需要的样本量少。然 而，它只能获得特殊酶切位点的甲基化情况，因此检测阴性不能排除样品DNA 中存在甲基 化的可能。 荧光定量法(Methylight) 此种方法利用TaqMan® 探针和PCR 引物来区分甲基化和未甲基化的DNA。首先用 亚硫酸氢盐处理DNA 片段，并设计一个能与待测位点互补的探针，随后开展实时定量PCR。 这种方法最大的优势在于其高通量和高敏感性，且无需在PCR 后电泳、杂交等操作，减少 了污染和操作误差。 Qiagen 就提供了多种预制的MethyLight 分析。EpiTect MethyLight PCR Kit 包括了两 条甲基化敏感的TaqMan 探针和2 条甲基化不敏感的PCR 引物。随着目标序列甲基化状态 的不同，只有FAM 标记的亚硫酸氢盐转化的甲基化DNA 特异的TaqMan 探针，或只有VIC 标记的亚硫酸氢盐转化的未甲化的DNA 特异的TaqMan 探针能与目标序列杂交。如果探针 与DNA 杂交则释放出荧光信号。信号强度与PCR 产物的量成正比，据此可计算出样品的 甲基化程度。 甲基化敏感性高分辨率熔解曲线分析 亚硫酸氢盐处理后，甲基化与未甲基化DNA 会存在序列差异，这种差异可通过熔解曲 线分析来发现，因为甲基化DNA 含有更多的GC，相对更难熔解。根据熔解温度及峰型的 变化，可轻易区分完全甲基化、完全非甲基化或杂合甲基化。高分辨率熔解(HRM)技术可检 出极微小的差别。 使用这种方法进行甲基化分析仅需一对引物，相比以往的方法更加快捷、简便和精确。 不过对仪器的要求颇高，需要带HRM 模块的荧光定量PCR 仪。目前市场上有多款PCR 仪 可满足要求，包括Illumina 的Eco、QIAGEN 的Rotor-Gene Q、罗氏 LightCycler 480 等。 焦磷酸测序 焦磷酸测序技术(Pyrosequencing)作为一种新的序列分析技术，能够快速地检测甲基 化的频率，对样品中的甲基化位点进行定性及定量检测，为甲基化研究提供了新的途径。 通过准确定量单个连续的CpG 位点上的甲基化频率，焦磷酸测序本身能检测并定量 甲基化水平上的细微改变。在序列延伸过程中，根据C 和T 的掺入量来定量确定单个位点 的C-T 比例。因此，不同位点的甲基化变异就能被准确检测。由于焦磷酸测序提供了真实 的序列数据，甲基化状态也就以序列形式呈