BiomicsCRISPRCas9基因敲除技术.pdfVIP

CRISPR/Cas9 基因敲除技术 CRISPR （ClusteredRegularlyInterspacedShortPalindromicRepeats ）RNA ，是最近几年才发现的原核生 物中的调控 RNA ，用以抵御病毒和质粒入侵。在II 型 CRISPR 系统中，CRISPR RNA （crRNA ）与转录激 活 crRNA （Trans-activating crRNA, tracrRNA ）退火形成的复合物能特异识别基因组序列，引导Cas9 核酸 内切酶在目的片段生成DNA 双链断裂（double-strand breaks, DSBs ）。CRISPR-Cas 系统的高效基因组编辑 功能已被应用于多种生物，包括人、小鼠、大鼠、斑马鱼、秀丽隐杆线虫、植物及细菌。多个科研小组的 研究都显示，与锌指核酸酶（ZFNs ）和转录激活样效应核酸酶（Transcription activator-like effector nucleases, TALEN ）相比较，CRISPR-Cas 系统介导的基因组靶向实验在真核细胞中具有相似甚至更高的效率。 Biomics 专注于 RNA 基因调控多年，最新推出基因组编辑工具 CRISPR/Cas9 专家系统，该系统灵活 简单、可以对特定基因组位点进行切割置换，特异性高、细胞毒性低。CRISPR/Cas9 系统可广泛应用于基 因组工程，如基因抑制，基因敲除，基因敲入，基因修复等。CRISPR-Cas9 体系的 RNA-DNA 识别机制为 基因组工程研究提供了一项简便而强大的工具。其最重要的优势是 Cas9 蛋白可在多个不同的 gRNA 的引导 下同时靶向多个基因组位点，起到多靶点调控的作用。 CRISPR 与 RNAi 的区别 目前已经广泛应用的RNAi 技术的靶标是 mRNA ，而 CRISPR 通过 RNA 识别 DNA 序列然后再 改变 DNA 序列，是可以遗传的。由于编码 mRNA 的 DNA 序列只占总 DNA 的极少部分，因此靶向 DNA 序列的 CRISPR 的靶标要比RNAi 广得多，更有可能筛选出针对某 DNA 序列的特异 CRISPR 靶 标。 作为一种新的基因编辑技术，CRISPR/Cas9 有以下特点和优势： 1、操作简单，靶向精确性更高。 sgRNA 靶向序列和基因组序列必须完全匹配，Cas9 才会对 DNA 进行剪切。编码 sgRNA 的序列不超过 100bp，因此比构建 TALENs 和 ZENs 更简单方便，用于 CRISPR 的 sgRNA 识别序列仅需 20 个核苷酸。 2 、CRISPR/Cas9 系统是由 RNA 调控的对 DNA 的修饰，其基因修饰可遗传。 3、基因修饰率高，基因调控方式多样，例如敲除、插入、抑制、激活等 4 、可实现对靶基因多个位点同时敲除。 5、无物种限制。 6、实验周期短，最快仅需 2 个月，节省大量时间和成本。 Biomics 提供以下 CRISPR/Cas9 专家系统服务 1、 与客户协商根据靶序列设计 RNA 序列（3 个工作日）； Biomics 具有丰富的 sgRNA 设计经验，提供的序列经过 blast ，优选脱靶效应最低的序列提交给客户。 此外，为进一步提高 sgRNA 的特异性和降低脱靶效应，我们提供双切口 sgRNA 对设计（Figure1 ）。。 Figure 1.Schematic illustrating DNA double-strandedbreaks using a pair of sgRNAs guiding Cas9 D10Anickases (Cas9n). 2 、客户根据自身需要选择 sgRNA 表达载体构建，或 sgRNA 体外转录合成（构建周期：10 个工作日） A 、sgRNA 表达载体构建,该构建载体为 Biomics 独有设计策略，连接效率更高，鉴定方法准确便捷。客户 可以根据自身需要选择载体构建服务或直接购买试剂盒 （Precut SgRNA Cloning kit pSD-gRNA Plasmid ） 质粒 pSD-gRNA 专门用于在哺乳动物细胞中表达 sgRNA，该质粒含 CMV 启动子驱动的 GFP 报告基因表达框，与 Cas9 表达质粒一起转染细胞即可以完成基因组编辑功能。此质粒由 Biomics 独立设计含氨苄抗性用于阳性克隆筛选，试剂盒 提供预剪切线性质粒，客户可以直接进行连接筛选阳性克隆，降低了客户酶切质粒不完全导致假阳性克隆