不同产地浙贝母的基因序列和生物碱含量比较.pdfVIP

维普资讯 · 栽培与育种 · 不同产地浙贝母的基因序列及生物碱含量比较 中国药科大学中药学院(南京210038) 蔡朝晖 李 萍 李松林 香港科技大学生物系生物技术研究所(香港) 董婷霞 詹华强 摘要 目的：探讨道地药材形成的基因基础。方法；以As和 AS_I为引物对4个不同产地浙贝母的5S-n~d~lA基 因间区进行了PCI{扩增和铡序，并采用酸性染料比色法测定了它们的总生物碱含量及用柱前衍生化气相色谱法测 定了其中2个单体生物碱的含量 。结果：不同产地浙贝母 的5S-rP~A基 因问区具有相同的碱基序列，均为 588bp； 它们的总生物碱含量相当，气相色谱结果也表明，它们含有相同的单体生物碱，只是各单体生物碱的含量不同。结 论：不同产地浙贝母的差异不是由碱基序列，而是由小环境因素引起的。 关羹词 浙贝母 道地药材 5S-rRNA基因问区序列 生物碱 道地药材是我国传统药物的一大特色，特指那 } l(pH8．0)、50mMEDTA、0．5％ SDS、0．2％ 巯基 些来源于特定产区的名优正品药材。中医多年的临 乙醇、饱和酚．氯仿(1：1)抽提过的上清液，加 0．1倍 床经验及近代分析均表明，同一物种在不同地区、不 体积的3M醋酸钠和 2倍体积 的 100％乙醇以沉淀 同生态条件下，质量差异较大。讲究道地药材是我 DNA，14，000rpm，4℃离心20min后弃上清液 ，室温 国历代医家保证药材质量的成功经验。药材的道地 干燥 ．加适量水溶解 DNA。提取的总DNA经 1％琼 性已成为药学研究的热点，其 中之一就是研究形成 脂糖凝胶电泳 ，溴化 乙锭染色后在紫外灯下观察拍 药材道地性 的原因。Mizukami等 “对不 同产地的 照 (U．V．Tramilluminator，IS-IO00Ⅸ talImagingSys· Cdehnialhtoralh的总 DNA用 RFLP法进行了分析 ， tern，AlphaInnotechCorporation)。 结果发现不同居群的样品间没有表现出遗传多态 2，2 PCR扩增 50 PCR反应混和液中含有 10× 性。 PCR缓冲液 (BoehringerMannheim)5 ，核苷酸混和 在高等植物 的真核细胞 中，5S．rRNA基 因以重 液 (分别含 10mM DTP、CIP、11lP、ATP)1 ，引物 复排列的形式存在，它包括 一个约 120 的编码 AS、AS-1，参照文献L7设计，并稍加修改，引物序列分 区，中间被 100～700bp的问区所分割00J。虽然 别为 AS：5-GGATCCGTG CITGccGGAGAgTAG 5S-rRNA基 因高度保守 ，但间区的序列在不 同的种 TA．3和 AS一1：3．GGA TCCTrAGTGCrCCTATGA 问甚至种 内都有差异 ，可以用于研究物种 间的遗传 TCGCA一5，浓度均为0．06． l，各取 2．s ，IUTaq 多样性。道地药材是否在基 因型上有所反映，本研 DNA聚台酶 ，约 50l1gDNA作为模板 。反应混台液 究以浙 贝母为例通过对 5S一 A基因间区的测序加 用石蜡油覆盖后 ，放置于 RobocycleGradient加 中进 探讨。浙 贝母 为百合 科浙贝母 肪 ／／／ar／athun- 行 PCR扩增。PCR扩增的循环条件为94℃ smin一 6e Miq．的干燥鳞茎，主要分布于江苏、浙江、安 94℃ lmin．53℃ 2mln，72℃ 3min，共 30个循环一 徽、湖北等省 ．具有清热化痰 、开郁散结等功效。本 72℃，10min。PCR产物在低温下保存。 研究对不同产地浙贝母的5S-删 A基因间区的碱基 2，3 亚克隆