Peptidepulldown方案译文.docVIP

Peptide Pull-down 方案 设计好的备用肽段（C端末尾加几个残基作为连接臂并且末端偶联生物素，）应被色谱纯化至纯度大于80%，等分，冻干，干燥环境下于—80度储存 1 连接肽段的珠子的制备：（注意，制备的所有步骤都应在冰上或最多4度的环境下进行） 1 用1mL磷酸盐缓冲液加0.1%的表面活性剂Triton X-100，冲洗400微升的亲和素珠（离心？（microcentrifuge），500RCF，30s）移去上清液，至少洗三次（洗去表面的保护剂，表面活性剂Triton X-100也促使疏水性的珠子与水相分离，否则无法得到上清液） 制备两个400 μL的珠子，其中一份不偶联肽段作为只有珠子的对照组。用装有毛细管凝胶的移液器尖端来取上清液，从而避免移去珠子 2 使100微克偶联生物素的肽段重新悬浮在400微升磷酸盐缓冲液（PBS）中 这些肽段的量足够配400 μL偶联肽段的珠子，做20次pull—down，如果珠子有着不同的连接生物素能力，注意将肽段和亲和素比例调整合适 3 将2中制备好的400微升重新悬浮的肽段加入400微升洗过的珠子中，旋转（rotation），在室温下温育3到5h 也可在4度过夜温育 4 用1 mL PBS + 0.1% Triton X-100冲洗连接了肽段的珠子至少三次，来移除未连接上的肽段 5 将偶联了肽的珠子重新悬浮在400微升磷酸盐缓冲液中来制备50%的悬浮液，在4度下储存 若长期储存，加叠氮化钠到浓度为0.1%，4度下至少可储存1个月。甲基化修饰稳定，磷酸化修饰不稳定 2 用固定好的肽段从复杂混合物中钓蛋白 一些一般原则： 1 在实验的每一步中都要确保蛋白酶抑制剂的使用，防止蛋白的降解。 2 都应在冰上或最多4度的环境下进行。 3 必须加未偶联肽的珠子作为阴性对照。 4 除HEPES缓冲液外在这次试验中也可使用其他缓冲液 5 所有肽段平行处理 制备蛋白质的复杂混合物 1 每次实验从108 数量级的细胞（问题：细胞培养）中制备新鲜核提取物，采用标准的高盐溶液提取方案 总量108 数量级的细胞一般来说基本足够了，最好用新鲜核提取物防止蛋白降解，不过提取物可先快冻在液氮中再在-80°C储存，从不同细胞系中提取是很重要的，因为有些蛋白在给定的细胞中表达的不是很好，此外考虑到所感兴趣的组蛋白翻译后修饰所涉及的细胞有丝分裂过程，与修饰同步的，正进行有丝分裂的细胞的核提取物是合适的，一些组蛋白连接的蛋白因子在420mM 浓度的盐溶液提取过程中不能被有效提取（比如那些和染色质连接很牢固的，这时就要考虑其他提取组蛋白方法了，比如用DNA水解酶或微球菌核酸酶来使组蛋白溶解） 2调整提取物的盐浓度到150毫摩每升：利用KCl盐浓度为150毫摩每升的缓冲液D透析或利用无盐缓冲液buffer D稀释，调整体积到每毫升108 当量细胞，（总蛋白浓度约为2.5μg/μL） 向buffer D加入新制的DTT, PMSF，蛋白酶抑制剂是很重要的 3 添加表面活性剂Triton X-100到提取物中使得Triton X-100浓度为0.1% Triton X-100对防止pull down过程中蛋白的非特异性连接很重要 4 最大速度（13200RCF）离心15到30min，清除所有沉淀，转移上清液到干净试管中 4°C下我们用13200转每分的台式离心机，等待一段时间来确保所有的可见沉淀都被从核提取物中清出，彻底移去所有沉淀是非常重要的，会显著减少非特异性连接的背景水平 复杂混合物与珠子的处理5 每份将80 μL （50%）的未偶联的珠子溶液（含40μL珠子），离心使成团（500RCF，30s），移除上清液 6 用500 μL Buffer D(含浓度为150 mM的 KCl)将珠子至少洗一次（500 RCF，30s，移去上清液，避免移走珠子） 7将制备的核提取物加到洗过的珠子中，在4度下轻轻旋转（rotation）温育30分钟 若方便可以增加温育时间，然而预清理时间在超过30分后，我们再没能观察到非特异性连接蛋白背景水平的下降。而且请记住这步不能从数量上减少非特异性连接的水平（只作为对照组） 8通过离心30秒使珠子集聚成团状（离心力调整为500RCF），用干净试管收集上清液来用于pull down 如果需要的话，再离心除去任何残余珠子 9取15 uL清澈的核提取物作为input 对照组用于之后的分析 偶联肽段珠子的准备 10每份取40uL,50%的珠子悬浮液（含20uL珠子） 偶联肽段的珠子的量可以根据蛋白与它结合的亲和力的强弱来调整，然而我们也发现当珠子体积超过20 uL只能增加背景干扰水平，不能增加特异性连接 11离心使珠子集聚成