不明原因反复自然流产和PAI—I基因4G.docVIP

不明原因反复自然流产与PAI—I基因4G/5G多态性的关系 潍坊市人民医院产二科 付锦华 自然流产是妊娠期常见的并发症之一，其发病率为10%—18%，原因不明的反复自然流产患者占其中的40—60%，近年来，提出遗传性易栓症与流产的概念，纤溶酶原激活剂抑制物—I（PAI—I）水平升高与血栓性疾病密切相关，且两者间存在基因多态性依赖关系[1，2] ，PAI—I基因启动因子区4G/5G多态性与早产、流产、死胎等妊娠并发症有关[3]，我们对PAI—I基因4G/5G多态性与反复自然流产的关系进行了研究，现报道如下： 对象与方法 对象：（1、）反复自然流产组：自2004年1月—2005年12 月来我院产科就诊，并经临床诊断的反复流产患者72例，平均年龄为29±4岁，所有患者既往有自然流产史（1—6次不等），本次妊娠出现先兆流产或B超诊断为宫内死胎，孕期均在3个月内，排除内分泌失调、感染、血型不合、生殖道异常等因素，夫妇双方外周血染色体检查核型正常，男方无精子畸形。（2）、正常妊娠对照组，随机选择正常妊娠妇女74例，年龄23—28岁，孕周26—41周。 方法：（1）基因组DNA抽取 采用酚/氯仿法。（2）PAI-I 基因扩增：引物位于5ˊ端启动子区，序列参照文献[2]的方法设计，由sangon公司合成。上游引物为；5，CACAGAGTCTGGCCACGT3，（C为非配对碱基）：下游引物为：CAGCCACGTGATTGTCATGGT3，。 潍坊市人民医院产二科 （261041） PCR反应体系为25ul，含基因组DNA100ng，10×PCR缓冲液2.5ul，mgcl21.3mmol；dNTPs各0.2mmol，引物各0.3umol，TagDNA聚合1.0U。PTC-100型扩增仪（美国MJ公司生产），循环参数：94℃30s、57℃30s、72℃30s35个循环，最后72℃延伸10min。经2.5%琼脂糖凝胶电泳，EB染色检测PCR产物。（3）、限制性内切酶消化及电泳分型：酶切反应体系20ul，含PCR产物3ul，限制酶BsII8U，10×酶切缓冲液2 ul，混匀后置55℃水浴，消化2.5h。12%的中性聚丙烯酰胺凝胶电泳，银染显色分析结果。 统计学方法：应用基因计数法计算基因频率基因型频率和等 位基因频率的比较采用x2检验，组间均数比较采用t检验。 结果： PAI-I基因多态性检测电泳结果 PAI-I基因4G/5 G多态性是指在转录起始上游675bp处存在1个鸟苷（G）插入或缺失，表现3种多态性，PAI-I基因PCR产物为142bp，经BSII酶切消化后产生不同的特异性片段，形成3种基因型。产生96bp和46bp2条带，即为4G/4 G基因型，产生74、46和22 bp3条带，即为5G/5G基因型，产生96、74、46和22 bp4条带，即为4G/5G基因型，其中22 bp条带在12%PAGE电泳2.5h后跑出胶外。自然流产组4G/4 G型占39.4%（30/76），4G/5G型占43.4%（33/76），5G/5G型占17.2%（13/76）。对照组4G/4 G型占14.9%（11/74），4G/5G型占58.1%（43/74），5G/5G型占27.02%（20/74）。两组比较，自然流产组4G/4G基因型频率显著高于妊娠组（p〈0.01〉，4G等位基因频率也显著高于对照组（P〈0.01〉。 两组人群PAI-I基因型和等位基因频率分布 组别 n 基因型频率 等位基因频率 4G/4G 4G/5G 5G/5G 4G 5G 自然流产组 76 30(39.4%) 33(43.4%) 13(17.2%) 0.612 0.388 正常妊娠组 74 11(14.9%) 43(58.1%) 20(27.02%) 0.439 0.561 讨论： PAI-I基因4G/5G多态性与血浆PAI-I的水平密切相关，存在基因型依赖关系，4G/4G基因型个体PAI-I的水平高于人群平均值约21%[4]；临床资料也证实，4G/4G基因型和4G等位基因与冠心病、急性冠脉综合征、视网膜静脉血栓发生也密切相关[4]。 反复自然流产的病因复杂，除免疫失调、内分泌紊乱、感染、染色体异常等因素外，基因多态性与自然流产也有关联，Glueck等[3]对122例妇女做了Leiden V因子、亚甲基四氢叶酸还原酶、凝血酶原和PAI-I基因4G/5G多态分析，发现存在基因突变的妇女发生早产、宫内发育迟缓的百分率明显增加，基因