分子医学实验-DNA多态性.docVIP

試寫出幾種檢測DNA多態性的基因技術 1．限制性片段長度多態性（Restriction Fragment Length Polymorphism，RFLP）：由DNA 的多態性，致使DNA 分子的限制酶切位元點及數目發生改變，用限制酶切割基因組時，所產生的片段數目和每個片段的長度就不同，即所謂的限制性片段長度多態性，導致限制片段長度發生改變的酶切位點，又稱為多態性位點。最早是用Southern Blot/RFLP方法檢測，後來採用聚合酶鏈反應（PCR）與限制酶酶切相結合的方法。現在多採用PCR-RFLP法進行研究基因的限制性片段長度多態性。 2．單鏈構象多態性（SSCP）：是一種基於單鏈DNA構象差別的點突變檢測方法。相同長度的單鏈DNA如果順序不同，甚至單個堿基不同，就會形成不同的構象。在電泳時泳動的速度不同。將PCR產物經變性後，進行單鏈DNA凝膠電泳時，靶DNA中若發生單個堿基替換等改變時，就會出現泳動變位（mobility shift），多用於鑒定是否存在突變及診斷未知突變。 3．PCR-ASO探針法（PCR-allele specific oligonucleotide, ASO）：即等位基因特異性寡核苷酸探針法。在PCR擴增DNA片段後，直接與相應的寡核苷酸探雜交，即可明確診斷是否有突變及突變是純合子還是雜合子。其原理是：用PCR擴增後，產物進行斑點雜交或狹縫雜交，針對每種突變分別合成一對寡核苷酸片段作為探針，其中一個具有正常序列，另一個則具有突變堿基。突變堿基及對應的正常堿 基勻位於寡核苷酸片段的中央，嚴格控制雜交及洗脫條件，使只有與探針序列完全互補的等位元基因片段才顯示雜交信號，而與探針中央堿基不同的等位元基因片段不顯示雜交信號，如果正常和突變探針都可雜交，說明突變基因是雜合子，如只有突變探針可以雜交，說明突變基因為純合子，若不能與含有突變序列的寡核苷探針雜交，但能與相應的正常的寡核苷探針雜交，則表示受檢者不存在這種突變基因。若與已知的突變基因的寡核苷探針勻不能雜交，提示可能為一種新的突變類型。 4. PCR-SSO法：SSO技術即是順序特異寡核苷酸法（Sequence Specific Oligonucleotide, SSO）。原理是PCR基因片段擴增後利用序列特異性寡核苷酸探針，通過雜交的方法進行擴增片段的分析鑒定。探針與PCR產物在一定條件下雜交具有高度的特異性，嚴格遵循堿基互補的原則。探針可用放射性同位素標記，通過放射自顯影的方法檢測，也可以用非放射性標記如地高辛、生物素、過氧化物酶等進行相應的標記物檢測。 5. PCR-SSP法：序列特異性引物分析即根據各等位元基因的核苷酸序列，設計出一套針對每一等位基因特異性的（allele-specific）、或組特異性 (group-specific)的引物，此即為序列特異性引物（SSP）。SSP只能與某一等位基因特異性片段的堿基序列互補性結合，通過PCR特異性地擴增該基因片段，從而達到分析基因多態性的目的。 6. PCR-螢光法：用螢光標記PCR引物的5’端，螢光染料FAM和JOE呈綠色螢光，TAMRA呈紅色螢光，COUM 呈蘭色螢光，不同螢光標記的多種引物同時參加反應，PCR擴增待檢測的DNA，合成的產物分別帶有引物5’端的染料，很容易發現目的基因存在與否。 7. PCR-DNA測序：是診斷未知突變基因最直接的方法，由於PCR技術的應用，使得DNA 測序技術從過去的分子克隆後測序進入PCR直接測序。PCR產物在自動測序儀上電泳後測序。常用方法有：Sanger雙去氧末端終止法;Maxam-Gilbert化學裂解法；DNA測序的自動化。目前DNA順序全自動鐳射測定法是最先進的方法。 8. PCR指紋圖法（PCR-fingerprints）：實用於快速的同種異型DR/Dw配型。在DR/DW純合子及雜合子個體中，每種DR單倍型及每種單倍型組合所產生的單鏈環狀結構的大小、數目和位置各異，由於同質雙鏈和異質雙鏈之間的分子構象不同。因此，在非變性聚丙烯醯胺凝膠電泳時，它們的遷移率各不相同，從而獲得單倍型特異的電泳帶格局即PCR指紋。也有人用人工合成的短寡核苷酸片段作為探針，同經過酶切的人體DNA作Southern blot，可以得出長度不等的雜交帶，雜交帶的數目和分子量的大小具有個體特異性，除非同卵雙生，幾乎沒有兩個人是完全相同的，就象人的 指紋一樣，人們把這種雜交帶圖形稱為基因指紋(gene finger-printing)。 9. 基因晶片法：又稱為DNA 微探針陣列（Micro array）。它是集成了大量的密集排列的大量已知的序列探針，通過與被標記的若干靶核酸序列互補匹配，與晶片特定位元點上的探針雜交，利用基因晶片雜交圖像，確定雜交探針的位置，便可根據堿基互補匹