5分子生物学的研究方法(上).pdf

第第 五五 章章 基因重组和基因工程基因重组和基因工程基因重组和基因工程基因重组和基因工程 GeneticGenetic RecombinationRecombination andand GeneticGenetic Engineering 重组ＤＮＡＤＮＡ •重组DNA：DNA分子内或分子间发生的遗传信息的重新共价组合过程， 广泛存在于各类生物广泛存在于各类生物。 •重组DNA技术是指将一种生物体 （供体）的基因与载体在体外进行拼接 重组重组，然后转入另然后转入另一种生物体种生物体 （（受体受体））内内，使之按照人们的意愿稳定遗使之按照人们的意愿稳定遗 传并表达出新产物或新性状的DNA体外操作程序 重组胰岛素的表达 一一、、、、重组重组重组重组DNADNADNADNA技术相关概念技术相关概念技术相关概念技术相关概念 （（一））DNNA克隆克隆 克隆(clone) 来自同一始祖的相同副本或拷贝的集合。 获取同一拷贝的过程称为克隆化(cloning) ， 即即无性繁殖无性繁殖。 技术水平：细胞克隆 个体克隆（动物或植物） 分子克隆(molecular clone) 即即DNADNA 克隆克隆 DNADNA 克隆克隆 应用酶学的方应用酶学的方 法，，在体外将各种来源的在体外将各种来源的 遗传遗传 物质 （同源的或异源的、原核的或真核的、天然 的或人工的DNA ）与载体DNA接合成一具有自我 复制能力的复制能力的DNADNA 分子分子—— 复制子复制子(replicon)(replicon) ，继而继而 通过转化或转染宿主细胞，筛选出含有目的基因 的转化子细胞，再进行扩增提取获得大量同一 DNADNA 分分 子子 ， 也也 称称 基基 因因 克克 隆隆 或或 重重 组组 DNADNA (recombinant DNA) 。 基因工程(genetic engineering) —— 实现基 因克隆所用的方法及相关的工作称基因工程， 又称又称重组重组DNADNA工艺学工艺学。 目的的 ①① 分 离离获得某得某一感兴趣的基因因或DNA ② 获得感兴趣基因的表达产物（蛋白质） （（二））工具酶工具酶 限制性核酸内切酶 Taq DNA 聚合 TT DNADNA 连接酶连接酶 4 重组重组DNNA技术中常用的技术中常用的工具酶具酶 工具酶 功 能 限制性核酸内切酶限制性核酸内切酶 识别特异序列识别特异序列，切割切割DNADNA DNA连接酶 催化DNA 中相邻的5´磷酸基和3 ´羟基末端之间形成磷酸 二酯键，使DNA切口封合或使两个DNA分子或片段连接 DNA聚合酶Ⅰ ① 合成双链cDNA分子或片段连接 ② 缺口平移制作高比活探针 ③③ DNA序列分析序列分析 ④ 填补3 ´末端 Klenow片段 又名DNA聚合酶I大片段，具有完整DNA聚合酶I 的5′→3′ 聚合、3′→5′外切活性，而无5′→3′外切活性。常用于 cDNA第二链合成，双链DNA 3′末端标记等 反转录酶 ① 合成cDNA ② 替代DNA聚合酶I进行填补，标记或DNA序列分析 多聚核苷酸激酶 催化多聚核苷酸5´羟基末端磷酸化，或标记探针 末端转移酶 在3 ´羟基末端进行同质多聚物加尾 碱性磷酸酶 切除末端磷酸基 限制性核酸内切酶