07流式应用的研究进展1112.ppt

流式细胞术 流式细胞术 从流式细胞术的发明、发展直到今天在各个领域应用的拓展,每一步都是诸如电子技术、流体力学、计算机科学、激光技术、生物学、生物技术、高等数学、临床医学、分子生物学、有机化学和生物物理学等学科知识综合运用的结晶。现代流式细胞术更是由于它结合单克隆抗体技术、定量细胞化学技术和定量荧光细胞化学,使其在生物学、临床医学、药物学、材料学等众多研究领域中的应用有更加突飞猛进的发展。 流式细胞术 流式细胞仪是测量染色细胞标记物荧光强度的细胞分析仪，是在单个细胞分析和分选基础上发展起来的对细胞的物理或化学性质（如大小、内部结构、DNA、RNA、蛋白质、抗原等）进行快速测量并可分类收集。 流式细胞术 流式细胞术 前向散射光（forward scatter, FSC）：激光束照射细胞时，光以相对轴较小角度(0.5°～10°)向前方散射的讯号用于检测细胞等粒子的表面属性，信号强弱与细胞体积大小成正比。 测得的FSC与SSC信号通过计算机处理，可得到FS-SS图，由此可仅用散射光信号对未染色的活细胞进行分析或分选。 此为血细胞分类的基本原理，但不能分析表面分子。 荧光信号由被检细胞上标记的特异性荧光染料受激发后产生，发射的荧光波长与激发光波长不同。 每种荧光染料会产生特定波长的荧光和颜色，通过波长选择通透性滤片，可将不同波长的散射光和荧光信号区分开，送入不同的光电倍增管。 选择不同的单抗及染料就可同时测定一个细胞上的多个不同特征。 线性放大器和对数放大器 荧光染料的特性 FSC：反映颗粒的大小 SSC：反映颗粒的内部结构复杂程度 FL：反映颗粒被染上的荧光数量多少 免疫细胞的检测 免疫细胞的分离 流式细胞术 免疫细胞的检测 免疫细胞的检测 免疫细胞的计数 T细胞及其亚群 Th细胞亚群 B细胞 NK细胞 流式细胞术 流式细胞术发展趋势: ①流式细胞仪从单纯大型仪器发展为适应各种实际应用的便携式、台式、分辨率、高质量分选的研究型流式细胞仪; ②对流式细胞术检测荧光参数,从采用荧光单色、双色分析发展为多色分析,目前最多可同时检测15 种荧光信号; ③从检测参数的相对定量发展为绝对定量; ④从检测参数的手动人工分析发展为利用计算机软件的自动分析; ⑤所采用的荧光试剂,从非配套试剂发展为配套的试剂盒试剂 流式细胞术在临床中的应用 流式细胞术目前已广泛地被应用于免疫学基础研究和逐步进入临床应用各方面，用流式细胞仪对细胞表面的抗原成分进行标记分析，可区别多种细胞的特性，为细胞免疫的研究增加了有效的手段和帮助。 流式细胞仪的临床应用 T淋巴细胞及其亚群分析 Th(CD3+CD4+CD8-T); Tc(CD3+CD4-CD8+T) B淋巴细胞及其亚群分析 B1(CD19+CD5+):产生IgM型自身抗体, 参与免疫调节、与自身免疫病的发生有关 B2(CD19+CD5-):受外来抗原刺激, 产生高亲和性特异性抗体 NK细胞分析 NK(CD3-CD16+CD56+) 二、淋巴细胞功能分析 细胞介导细胞毒性试验(死细胞与活细胞比例) 细胞内细胞因子测定 四、肿瘤耐药基因分析 六、自身免疫病相关HLA抗原分析 流式细胞仪的科研应用 免疫功能研究（淋巴细胞亚群分析、细胞活化、细胞因子） 磷酸化蛋白的检测 干细胞研究/树突细胞研究 细胞功能研究（细胞内PH值、细胞内钙离子流、细胞膜电位、线粒体膜电位） 血小板分析（心脑血管疾病） 肿瘤相关基因表达的研究 抗肿瘤药物作用机制以及多药耐药性的研究 细胞周期和倍体分析 细胞凋亡及凋亡相关蛋白 转染基因沉默效率检测 细胞分选、分选后培养及相关生物学研究 近期流式应用研究进展 细胞因子检测 树突状细胞 调节性T细胞 细胞因子检测 细胞活化 细胞因子 细胞因子相关的主要研究领域 肿瘤 肾炎 感染（SARS/禽流感） 自身免疫病 超敏反应 移植排斥反应 免疫缺陷病 血液疾病 胞内因子测定 原理： 未活化的细胞所分泌的细胞因子很少，很难在流式细胞仪上检测。 需用刺激剂PMA+Ionomycin等激活细胞分泌细胞因子， 为了阻止产生的细胞因子分泌到细胞外，需要同时加入BrefedlinA或Monensin等共孵育细胞，使胞内细胞因子蓄积。 胞内染色前需用多聚甲醛固定，保留细胞形态完整性和胞内物质抗原性，随后用皂角苷（破膜剂）增加细胞膜通透性，使细胞因子特异性抗体渗入到胞内，达到流式细胞仪检测目的。 树突状细胞（dendritic cell，DC） 体外人DC制备 前体DC来源 外周血单个核细胞/单核细胞 密度梯度离心 BD? IMag Cell Separation System 骨髓、新生儿脐带血的CD34+细胞 在细胞因子（如GM-CS