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ICS 67.050 X 04 中华人民共和国国家标准 农业部869号公告-8-2007 转基因植物及其产品成分检测 抗虫和耐除草剂玉米Bt176及其衍生品种定性PCR方法 Detection of genetically modified plants and derived products Qualitative PCR method for insect-resistant and herbicide-tolerant maize Bt176 and its derivates 2007-06-11发布 2007-08-01实施 前 言 本标准由中华人民共和国农业部提出。 本标准归口全国农业转基因生物安全管理标准化技术委员会。 本标准起草单位：农业部科技发展中心、吉林省农业科学院、上海交通大学、香港基因晶片开发有限公司、上海市农业科学院、山东省农业科学院。 本标准主要起草人：张明、厉建萌、杨立桃、李飞武、刘乐庭、刘信、潘爱虎、路兴波、付仲文、李葱葱。 转基因植物及其产品成分检测 抗虫和耐除草剂玉米Bt176及其衍生品种定性PCR方法 1　范围 本标准规定了转基因抗虫和耐除草剂玉米PCR检测方法。 抗虫和耐除草剂玉米PCR检测。 2　规范性引用文件 下列文件中的条款通过本标准的引用而成为本标准的条款。凡是注明日期的引用文件，其随后所有的修改单（不包括勘误的内容）或修订版均不适用于本标准，然而，鼓励根据本标准达成协议的各方研究是否可使用这些文件的最新版本。凡是不注明日期的引用文件，其最新版本适合于本标准。 NY/T 672 转基因植物及其产品检测 通用要求 NY/T 673 转基因植物及其产品检测 抽样 NY/T 674 转基因植物及其产品检测 DNA提取和纯化 3术语和定义′端与玉米基因组的连接区序列，包括bar终止子3′端部分序列和玉米基因组的部分序列。 4　原理 根据转基因抗虫和耐除草剂玉米Bt176转化体特异性序列设计特异性引物，对试样进行PCR扩增是否含有。 5　试剂和材料 除非另有说明，仅使用分析纯试剂和重蒸馏水。 5.1　琼脂糖 5.2　10 g/L溴化乙锭溶液溴化乙锭（EB） 注：有致癌作用，配制和使用时应戴一次性手套操作。 称取80 g氢氧化钠（NaOH），先用160 mL水溶解后，再加水定容200 mL。500 mmol/L乙二铵四乙酸二钠溶液pH 8.0）：称取18.6 g乙二铵四乙酸二钠（EDTA-Na2），加入70 mL水中，再加入溶液，加热溶解后，冷却至室温，用调pH至8.0，水定容100 mL。在103.4 kPa（121℃）条件下灭菌20 min。1 mol/L三羟甲基氨基甲烷-盐酸溶液pH 8.0）：称取121.1 gTris）溶解于800 mL水中，用盐酸调pH至8.0，水定容至1000 mL。在103.4 kPa（121℃）条件下灭菌20 min。TE缓冲液（pH 8.0）10 mL三羟甲基氨基甲烷-盐酸溶液（）和2 mL乙二铵四乙酸二钠溶液（），水定容至1000 mL。在103.4 kPa（121℃）条件下灭菌20 min。 50×TAE缓冲液称取242.2 g，先用300 mL水加热搅拌溶解后，加100 mL乙二铵四乙酸二钠溶液（），用乙酸调pH至8.0，然后水定容1000 mL。使用时用水稀释成1×TAE。 加样缓冲液称取250g溴酚蓝，加10 mL水，在室温下溶解；称取250g二甲基苯腈蓝，用10 mL水溶解；称取50 g蔗糖，用30 mL水溶解，混合三种溶液，水定容至100 mL，在4℃下保存。 DNA分子量标准 5.10　dNTPs混合溶液：将浓度为10 mmol/L的dATP、dTTP、dGTP、dCTP四种脱氧核糖核苷酸等体积混合。Taq DNA聚合酶（5 U/μL）及PCR反应缓冲液 5.12　引物 5.12.1　zSSIIb基因。 zSSIIb-F：5′-CGGTGGATGCTAAGGCTGATG-3′； 5′-AAAGGGCCAGGTTCATTATCCTC-3′； 预期扩增片段大小为bp。 5..2　Bt176转化体特异性序列。 Bt176-F：5′-AAGCACGGTCAACTTCCGTAC-3′； 5′-TCGACTTTATAGGAAGGGAGAGG-3′；预期扩增片段大小为bp。 引物溶液 用TE缓冲液（）分别将上述引物稀释到10 μmol/L。PCR产物回收试剂盒 6　仪器 6.1　分析天平，感量0.1 mg。 6.2　PCR扩增仪6.3　电泳槽、电泳仪等电泳装置6.4　紫外透射仪6.5　凝胶成像系统6.6　重蒸馏水发生器6.7　其他分子生物学实验室仪器设备7.1