荧光PCR实验故障排除.pdf

荧光PCR实验故障排除 扩增曲线-Amplification Plot 2 标准曲线-Standard Curve 3 原始数据-Component 4 各波长的原始信号-Spectra 5 融解曲线-Dissociation Curve [原始图谱] [导数图谱] 6 没有标准曲线 7 没有标准曲线 8 没有扩增曲线 Amp Plot Component 9 没有扩增曲线 Spectra 原始数据只有1个循环 10 没有扩增曲线 原因1：PCR参数设置错误 数据收集步骤只有一个循环，只收集了一个数据点。 11 没有扩增曲线 原因2 ：硬盘休眠 电脑休眠，数据通讯中断 12 基线下滑 13 基线下滑 从原始数据找原因 从第1-第9个循环，ROX的信号逐渐下降，这与所用试剂的质量有关。 在所设定的4-13基线范围内，ROX信号值是变化的，而FAM的信号值基本上是固定的， 经过FAM/ROX的校正后，基线不是水平的直线，而有下滑部分。 应该取ROX信号稳定的10-20循环为合理的基线范围。 14 基线下滑 修改基线范围为10-20，重新分析。 15 基线下滑 基线范围取10-20循环的数据，重新分析后的图谱。 第1-9循环的信号为负数，由于试剂质量引起。 16 奇怪的荧光曲线 原因：基线的终点大于C 值 T 通常是因为模板DNA浓度偏高，CT值 15，而基线范围仍然取3- 15，其中包含部分扩增信号，导致标准差偏大，阈值过高 解决方法：减小基线终点至CT值前4个循环，重新分析数据 17 样品浓度很高 18 直线扩增曲线 原因：探针部分降解 19 V形扩增曲线 20 V形扩增曲线 • 双击纵坐标，打开Graph Settings • 关闭Y轴Auto Scale • 设置到正常范围如0-12000 21 V形扩增曲线 • 扩增曲线是水平直线 •没有检测到信号升高－提示没有扩增 22 扩增微弱或者信号很弱 23 ROX信号不稳定 24 扩增曲线不光滑 Rn 25 扩增曲线不光滑 原因：信号太弱 如果信号10000点，就不会