生物分离-细胞破碎.pptVIP

细胞破碎 胞内产物：胞内酶、大部分重组蛋白等。 细胞破碎：破坏细胞壁或细胞膜 二、细胞破碎方法 物理方法 高压匀浆、珠磨、超声波破碎、喷雾撞击破碎、研磨、旋刀式匀浆等（机械破碎） 冻融、低渗裂解 1、高压匀浆法 在工业规模的细胞破碎中，对于酵母等难破碎的及高浓度的细胞悬液，常采用多次循环的操作方法。其破碎属于一级反应速度过程，被破碎的细胞分率符合下式，破碎的动力学方程可表示为： 高压匀浆法适合于酵母和细菌的大规模破碎 不适于团状或丝状菌破碎 2. 珠磨法 搅拌设计要能够给予研磨剂以最佳推动力，一般设计为搅拌盘。搅拌盘与驱动轴有同心的，也有偏心的；有垂直的，也有倾斜的。有的搅拌盘上有凹槽或是开度口以帮助搅拌。 3、超声波破碎 空穴作用： 在超声作用下液体发生空化作用，空穴的形成、增大、闭合产生极大的冲击波和剪切力，使细胞破碎 优点： 适合于多种细胞的破碎 处理少量样品操作方便，液体损失少，破碎率高 缺点： 有效能量的利用率低，产热大，需控温（冰水或通冷却剂）； 不易放大，仅应用于实验室规模的细胞破碎； 影响因素多，细胞种类、浓度、超声波的声频等 4.低渗裂解（渗透压冲击） 高渗溶液（如20%蔗糖、高浓度盐或甘油）中转到冷水中 适合细胞壁脆弱的细胞（动物细胞、革兰氏阴性菌）。 可分离细胞间质蛋白 5. 冻融 急冻后室温缓慢融化，反复多次 破坏细胞膜的疏水键，增加其亲水性和通透性； 胞内结晶引起细胞内外浓度变化，细胞膨胀破裂。 破碎率低 其他物理方法：研磨（细菌、植物细胞） 旋刀式匀浆（大多数动植物组织） 化学方法 1. 酸碱处理 破坏细胞壁和细胞膜，适用于酸碱稳定的产品 如：细菌L-天门冬酰胺酶的提取，将菌体悬浮在pH11~12.5的碱溶液中，振荡20min即可。 2. 有机溶剂处理 甲苯、丙酮等 溶解脂类物质，增加细胞壁和细胞膜通透性，可实现选择性释放。 3. 表面活性剂处理 十二烷基硫酸钠SDS、Triton X-100等 溶解脂蛋白和脂类，作用细胞壁和细胞膜，增加通透性 动物细胞完全破碎 有机溶剂和表面活性剂处理特点： 胞内产物总释放率低，核酸留在胞内，料液黏度低，避免大量细胞碎片，有利于后处理 破碎率低，加入试剂会形成新的污染 生物方法 1. 酶法 革兰氏阳性菌: 溶菌酶(水解肽聚糖层)； 革兰氏阴性菌： 溶菌酶＋EDTA 二价阳离子特别是Mg2＋对细胞壁外层具有稳定作用 酵母：溶壁酶(Zymolyase)、葡聚糖酶、甘露糖酶等； 植物细胞：纤维素酶 特点：操作条件温和，产物破坏小，费用高 溶菌酶(lysozyme): 作用于NAM的G1和NAG的C1-C4之间的糖苷键，所以又称乙酰胞壁质酶。 对G-菌，在EDTA存在下，受溶菌酶作用。 溶菌酶处理后的菌细胞应保存在弱高渗（0.1 ～0.2M）蔗糖液中。图中箭头为溶菌酶的水解点。 ???? 溶菌酶的作用过程： ????  2. 自溶 一定pH和温度下诱使细胞产生溶解自身的酶； 一般采用加热法，自溶时间较长，必要时加甲苯、氯仿等防止微生物生长； 酵母45~50℃ 20h发生自溶。 可将多种破碎方法联合使用提高破碎效果。 青霉素(penicillin): 作用于肽聚糖肽桥的联结，即抑制肽聚糖的合成，故仅对生长着的菌有效，主要是G+菌。 菌体细胞壁合成受抑制，可促使胞内产物的分泌 三、目标产物的选择性释放 按是否使用外加作用力可将常用的破碎方法分为机械法和非机械法两大类。 四、破碎率的测定 a. 直接测定 利用显微镜观察或计数；染色可将破碎细胞和完整细胞区分开。 如革兰氏染色能将破碎后的革兰氏阳性菌染成阴性菌的颜色； 受损的酵母细胞为亮红色，未受损的酵母细胞为紫色。 b. 测定释放的蛋白量或酶活 将破碎后的细胞悬液离心，测定上清液中蛋白浓度或酶活。 c. 测电导率 电导率随破碎率的增加而线性增加 五、细胞破碎的发展趋势 1、多种破碎方法相结合 化学法与酶法取决于细胞膜