新型小片段基因表达载体构建方法.pdfVIP

中国生物工程杂志　ＣｈｉｎａＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，２０１２，３２（６）：５７６３ 檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪殏 檪 殏 檪 檪 技术与方法 殏檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪殏 新型小片段基因表达载体构建方法 １，２ ２ ２ 金　磊 　赵文秀 　马　岚 （１清华大学生命科学学院　北京　１０００８４　２清华大学深圳研究生院生命与健康学部　深圳　５１８０５５） 摘要　介绍一种新型快速构建小片段基因表达载体的方法。该方法省去了目的基因酶切和酶切 后纯化步骤，并省去了载体酶切后胶回收纯化步骤，具有简单快速，节省试剂费用，连接效率高等 特点。应用该方法已经完成了４个小片段基因（６７ｂｐ）表达载体的构建。 关键词　小片段　表达载体　有效碰撞 中图分类号　Ｑ８１９ ［１］ 　　载体构建是分子生物学实验中一项基本技术，涉 于ｓｉＲＮＡ设计中 。本文竞争性连接原理的提出，是 及很多生物技术方法，如引物设计，ＰＣＲ，限制性内切酶 来源于化学学科中的有效碰撞原理，连接反应也是一 酶切，连接效率等。当实验步骤多的时候，每一步的准 个化学反应，当在连接时，单位时间内分子数多的片段 确性控制比较困难，增加了操作难度。当小片段基因载 分子更加容易与载体分子接触，有效分子浓度更高，更 体构建时，小片段的ＰＣＲ技术比较困难，酶切也常出现 容易发生连接反应，减少载体自连反应。 星星活性，尤其是在酶切回收步骤，也常出现酶切后的粘 　　本实验选取了４个小片段基因，探讨了这种新方 性末端被降解。所以需要采取办法避免这些常见问题。 法的可行性。 　　本文提出的改进方法是基于小片段基因寡聚核苷 酸合成技术和竞争性连接原理，省去了目的基因的酶 切步骤，和省去了载体酶切后胶回收纯化步骤。该方 法是先合成带酶切位点的寡聚核苷酸片段，退火后与 相同酶切的载体连接。具体流程是低浓度载体酶切 后，将限制性内切酶在６５度下灭活处理，不做纯化实 验；处理后的低浓度载体与退火得到的小片段基因进 行连接反应，此时小片段基因由于浓度远高于载体浓 度，即小片段分子数明显多于载体分子数，通过竞争能 有效地克服载体自连，小片段基因高概率连接到载体 上，流程如图１。竞争性连接原理是基于化学反应原理 图１　实验流程示意图 中的分子有效碰撞，它是本文新型方法提出的基础，运 Ｆｉｇ．１　Ｔｈｅｆｌｏｗｃｈａｒｔｏｆｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔ 用该原理是本文新方法的最主要创新之处。目前生物 公司可以合成一定片段长度的寡聚核苷酸，避开了小 １　材料与方法 片段基因的ＰＣＲ，合成后通过缓慢降温退火可以很容 易得到带粘性末端的小片段目的基因，这种方法常用 １．１　菌种、质粒和主要试剂 收稿日期：２０１２０２０７　　修回日期：２０１２０３２８ 　　大肠杆菌菌株 ＢＬ２１，谷胱甘肽转硫酶（ＧＳＴ）融合 国家“８６３”计划资助项目（２００６ＡＡ０３Ｚ３５９） 蛋白原核表达载体ｐＧＥＸＫＧ均为本实验室保存；Ｅ．Ｚ． 通讯作者，电子信箱：ｍａｌａｎ＠ｓｚ．ｔｓｉｎｇｈｕａ．ｅｄｕ．ｃｎ ＴＭ  Ｎ．Ａ． ＰｌａｓｍｉｄＭｉｎｉＫｉｔＩ（Ｄ６９４３０１）购自ＯＭＥＧＡ ５８ 中国生物工程杂志 ＣｈｉｎａＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ