白藜芦醇抗肿瘤分子机制的探讨.pdfVIP

作者简介：冯磊(1974-)，男，江苏省无锡人,博士研究生，专业方向：生物制药、分子药理。 金坚(1960-)，男，教授，博士生导师，长期从事分子药理学的研究。 Tel：(0510) E-mail：feng2000lei@, jinjian31@ 白藜芦醇(3,4,5-trihydroxystilbene)属于非黄酮类多酚化合物，在植物 体内常以顺、反式两种构型共存，反式白藜芦醇是主要的生物活性异构体。白藜 芦醇最初的天然资源是葡萄皮和红酒。仅在几年以前，白藜芦醇才引起人们的注 意，被作为法国人吃高脂肪食物而心脏病发病率较低[1] 这一“法兰西怪 事”(France Paradox)的可能解释，而且发现白藜芦醇能减少血小板的聚集及血 栓的形成和减少冠状动脉粥样心脏病的发生[2, 3] 。随着对白藜芦醇研究的深入， 许多作者发现它具有抗肿瘤特性和抗氧化、抗突变、抗炎作用，对鼻咽癌、肺癌、 肝癌、肠癌、胃癌、乳癌、白血病等均有拮抗作用[4, 5] ，但是关于它的抗肿瘤分 子机制研究很少。 本文通过MTT 实验、光学显微镜观察细胞形态、流式细胞仪检测、、噬菌体 展示技术、ELISA 法、Western blot 杂交法、亲和甄别磁珠等方法研究观察白藜 芦醇对耐阿霉素人乳腺癌细胞系MCF-7/ADM 的增殖与细胞周期的影响，并且探 讨其结合的靶点蛋白质。结果首次发现白藜芦醇对耐阿霉素的MCF-7/ADM 细胞 有直接的细胞增殖抑制作用，而对人体的正常肝细胞毒性很小，是一种有潜力的 抗肿瘤药物前体分子。 1．实验材料与实验方法 1.1 主要材料、试剂及仪器 MTT、生物素(Sigma 公司)、RPMI Medium 1640细胞培养基（Gibco BRL公司）、 胰酶、小牛血清、L-谷氨酰胺（华美生物工程公司）、Model3110细胞培养箱 （Thermo-Forma 公司）、MK3型酶标仪 （Thermo-Labsystems公司）、BX-40光学显 微镜 （Olympus 公司）、EPICS XL 型流式细胞仪 （美国Coulter公司）、PI （SIGMA 公司）、RNA 酶（Progema公司）、Mini-PROTEAN 3 Cell 电泳槽（Bio-Rad公司）、 蛋白质Markers 14,400-97,400（中国科学院上海生物化学研究所）、Cdk2 (C-term) 兔单克隆抗体（美国Epitomic公司）、噬菌体12肽库试剂盒(＃E8110SC; New England Bio-labs公司)、HRP 标记的抗M13 单克隆抗体 (Pharmacia. Biotech. 公司)、ABTS (AMRESCO 公司)、亲和甄别磁珠 （标有亲和素）和磁力收集器 （美 国promego公司)、Triton X-100 （AMRESCO公司）。 白藜芦醇（色谱纯度为99%、湖南省洪江华光生物有限责任公司）、生物素 化白藜芦醇（实验室自制）[6] 、其他试剂均为国产分析纯。 1.2 细胞系 人胎正常肝细胞L-02 （中国科学院上海细胞库提供），人乳腺癌上皮细胞 MCF-7 的阿霉素耐药株MCF-7/ADM 细胞 （江南大学细胞和分子药理学实验室金坚 教授馈赠，该细胞撤阿霉素培养150 天后耐药指数仍维持在200 倍以上，并对多 种化疗药物产生耐药性）[7] 。 1.3 细胞培养 MCF-7/ADM细胞培养在经过0.22 μm 滤膜过滤的RPMI 1640培养液中(含10% 热灭活小牛血清,0.2%NaHCO3 ,青霉素100U/mL 和链霉素100 μg/mL) ,在37℃、 5%的CO2、饱和湿度下培养,用D-Hanks 配制的0.3%的胰蛋白酶消化细胞传代。 1.4 MTT 法测定细胞增殖曲线 取对数生长期的MCF-7/ADM 细胞用0.3 %胰蛋白酶消化并制成单细胞悬液， 按每孔6000-7000 个细胞接种于96 板，每孔150 μL，置于37℃、5% CO2 培养 箱培养24 h，再加入用完全培养基将白藜芦醇稀释成不同浓度的样品溶液150 μL，并设置空白对照组，每组设8 个复孔，继续培养72 小时。培养结束后，每 孔加MTT(5 mg/ml)20 μl,继续培养4 h，然后弃上清液，每孔加DMSO150 μl， 37℃孵育10 min，用酶标仪测定OD570，计算抑制率。