人腰椎间盘退变差异性表达microRNA的筛选及JNK通路参椎间盘退变探讨.pdfVIP

退变的探讨 天津医科大学总医院骨科 王涛王玉龙 天津医院 马信龙张晓林臧加成 1．获取腰椎退 测其靶基因；探讨JNK信号转导通路在IVDD分子生物学机制中发挥作用的可能。方法 行性疾病患者手术髓核组织8份和腰椎骨折患者正常髓核组织3份。依次进行髓核细胞分离、培养、染色 time qPCR技术对其中高表达者进行验证；分析预测靶基因，应用统计学方法分析与差异基因或靶基因功 合；综合三种软件MicroCosm v5、TargetScan 两种靶基因均参与JNK信号通路。结论本研究首次通过生物芯片技术筛选出退变椎间盘中高表达的miR一 的发病机制中发挥了重要作用。 关键词椎问盘退变；microRNA；心K信号传导通路 前言 disc 椎间盘退变(intervertebral 归因于细胞凋亡及细胞代谢水平的下降，并且自身免疫炎症反应亦发挥重要作用。目前，学术界普遍认 为：多种因素的互动和叠加，造成了间盘结构与功能的破坏，进而造成间盘细胞基因表达的恶性循环， 髓核细胞凋亡程序被启动，最终导致IVDD。对于以IVDD为前提和基础的椎间盘突出疾病，基因治疗被 寄予厚望，希望能够通过对细胞信号传导通道的影响达到有效保持细胞代谢活性、减慢IVDD的进程，从 而起到预防间盘突出发生、延缓病情的作用。然而，我们对于IVDD相关基因及其调控机制的问题仍未得 导IVDD发病机制的细胞信号传导通道的类型，进而推论该疾病的分子生物学机制，探索基因水平诊断和 治疗间盘疾患的新思路。 材料和方法 一、研究对象 (一)实验材料 取材于天津市骨科医院脊柱外科腰椎退行性疾病患者，手术中切除的退变髓核组织块8例，其中3例 用于筛选实验，5例用于验证实验。对照组取材于腰椎爆裂骨折病人，手术行前路减压髓核切除的组织块 3例，其中1例用于筛选实验，2例用于验证实验。 (二)纳入标准和排除标准 本研究的纳入标准为： (1)根据临床症状和体征、X线片、CT、MRj表现诊断为腰椎间盘突出症， ·464· 病变间盘退行性改变明显，对照组病患腰椎间盘无影像学退变改变，年龄小于25岁；排除标准为： (1) 病人既往体健，排除肿瘤、感染、类风湿性关节炎和干燥综合症等自身免疫疾病； (2)排除近期免疫抑 制剂治疗。 二、研究方法 (一)主要试剂和仪器 1)百级层流实验室(天津医院细胞工程室) 2)荧光显微镜(Nikon公司，日本) 3)倒置相差显微镜(Olympus，日本) 4)全自动酶标分析仪(MIⅨ一HD公司，美国) 5)恒温水浴箱：HWC．52型(上海天平仪器厂) 6)二氧化碳培养箱(Hera—cell公司，德国) 7)恒温摇床(Heidolph公司，德国) 8)青／链霉素(Gibco公司，美国) 9)高糖DMEM培养基(Gibco公司，美国) 10)10％胎牛血清、EDTA(Sigma公司，美国) 11)II型胶原酶、I型胶原酶、胰蛋白酶(Sigma公司，美国) 12)瑞氏一姬姆萨染色、甲苯胺蓝(Sigma公司，美国) 13)Trizol试剂(Invi仃ogen公司，美国) 14)RNA保存液(北京康为世纪生物科技有限公司，北京) real—timePCR检测仪(Bio—Rad公司，美国) 15)iQ5 16)肚in—0IlelMmiIiNA ，美国) 1物(GeneCopoeia公 qR：H，CR试剂盒、All-in-OneTMmiRNAqPCR7 (二)实验方法 1、miRNA筛选实验方法 (1)、髓核细胞的分离、