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实验三 糖化酶活力的测定 一、目的和内容 目的：学习测定糖化酶活力的原理并掌握 测定糖化酶活力的方法 内容：１. 学习糖化酶活力的原理． 　　　２. 测定并计算糖化酶活力． 二、糖化酶简介以及其活性的测定原理 ① 糖化酶的应用及生产 ② 糖化酶的催化原理 ③ 酶活测定方法 ① 糖化酶的应用与生产 糖化酶，全名葡萄糖淀粉酶（Glucoamylase EC.3.2.1.3），又名淀粉葡萄糖苷（Amyloglucosidase）或γ-淀粉酶（γ-amylase），是一种含有甘露糖、葡萄糖、半乳糖和糖醛酸的糖蛋白，分子量在60～1000kDa 之间。因发酵工业中大量用作淀粉糖化剂，习惯上简称糖化酶。 糖化酶在工业生产中的应用： 糖化酶是淀粉糖化发酵生产酒精和葡萄糖浆的主要酶类。特别是酿酒酵母利用淀粉原料发酵时，淀粉液化后的糖化作用是必不可少的工序，因为大多数酿酒酵母只能利用可发酵的糖进行酒精发酵。 糖化酶不仅用于酒类、酒精生产和葡萄糖浆的制取，还广泛地用于抗生素、氨基酸、有机酸的生产。糖化酶是我国产量最大、应用最广的酶制剂之一。 目前，工业中广泛使用黑曲霉(Aspergillus niger)、泡盛曲霉(Aspergillus awamori)、米根霉(Rhizopus oryzae)和臭曲霉(Aspergillus foetidus)为生产菌株来发酵生产糖化酶。 今天的实验用酶就是利用黑曲霉变异菌株进行液体深层通风发酵后提取获得。 ②糖化酶的作用机制 糖化酶是由一系列微生物分泌的具有外切酶活性的胞外酶。糖化酶的主要作用是从淀粉、糊精、糖原等碳链上的非还原性末端（整个碳链只有一个还原端，与之相对的都是非还原端）依次水解a- 1,4 糖苷键, 切下一个个葡萄糖单元，并像β- 淀粉酶一样, 使水解下来的葡萄糖发生构型变化，形成β- D- 葡萄糖。对于支链淀粉，当遇到分支点时，它也可以水解a- 1,6 糖苷键，由此将支链淀粉全部水解成葡萄糖。糖化酶也能微弱水解a- 1,3 连接的碳链，但水解a- 1,4 糖苷键的速度最快，它一般都能将淀粉百分之百地水解生成葡萄糖。 ③酶活测定方法测定糖化酶的方法有次碘酸钠法、兰–爱农法（ＳＰ法） 、Schoorl法（ＤＵ法）和对硝基苯酚葡萄糖法（ＮＰＧ法）、3,5-二硝基水杨酸(DNS) 等方法。 本试验测定糖化酶活力采用次碘酸钠法。糖化酶以可溶性淀粉为底物在一定条件下（pH范围是4～6, 温度范围是40～60℃）进行反应，生成的葡萄糖用次碘酸钠法定量测定。以单位时间内分解α–１，４糖苷键生成葡萄糖所需的酶量为酶的活力单位。 次碘酸钠法： 碘与NaOH作用能生成NaIO，而葡萄糖能定量地(1:1)被NaIO氧化在酸性条件下，未与C6H12O6 作用的NaIO可转变成I2 析出,因此只要用Na2S2O3 标准溶液滴定析出的I2 ，便可计算出未参与反应的NaIO ，由此推导出糖化酶催化所产生的C6H12O6 的含量。 1.I2 与 NaOH作用: I2 +2 NaOH=NaIO +NaI +H2O 2.C6H12O6 与NaIO定量作用: C6H12O6 +NaIO =C6H12O7 + NaI 3. C6H12O6反应完后,剩余的NaIO在碱性条件下发生歧化反应: 3 NaIO=NaIO3 +2 NaI 4.歧化产物在酸性条件下进一步作用生成I2: NaIO3 +5NaI +6H2SO4=3I2 +6Na2SO4+3H2O 5.析出的I2 可用标准Na2S2O3 溶液滴定之: I2 +2Na2S2O3 =Na2S4O6 +2NaI 注释： 在这一系列的反应中，1mol葡萄糖与1mol NaIO作用，而1molI2产生1molNaIO，因此，1mol葡萄糖与1molI2 相当。只要得出对照组和实验组所消耗的硫代硫酸钠体积，两者相减就可以得出与葡萄糖反应的那部分次碘酸钠的量，从而可以确定酶解生成的葡萄糖的量，从而计算出酶活。 三、试剂与器材 1.糖化酶试剂； 2.微量滴定管、滴定台、试剂瓶、试管、三角瓶、pH计、电子天平； 3.试剂 2%可溶性淀粉溶液；pH4.6、0.1mol/L的醋酸缓冲液； 0.1mol/L碘液；0.1mol/L氢氧化钠溶液； 2mol/L硫酸溶液； 0.1N硫代硫酸钠溶液；0.5%淀粉指示剂。 四、操作步骤 1. 取7个带塞的试管（其中3个测今年批次的酶活、另外3个测去年批次的酶活、1个作空白对照），分别吸取2%可溶性淀粉液5ml，加入pH4.6醋酸缓冲液2.5ml，混匀后于40 ℃水浴中预热10min。 2. 加入酶液0.5ml（