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实验十 pUC57 T载体的制备 一．原理 PCR产物的克隆是一种有效的克隆目的基因的方法，但是在实际应用中，由于方法学上 的一些技术问题可能限制其应用。由于PCR产物3`末端突出一个A，因此克隆PCR产物的 载体3`末端必须突出一个T，这样载体与PCR产物之间形成粘性长端。现在许多公司开发 出了此类专用于PCR产物克隆的T载体。本实验中将平端内切酶EcoRv酶解的EcoRv，用 Taq酶将其3`末端加上T，然后用T4连接酶将能自身环化的质粒连接。用凝胶电泳将自身 环化的质粒与3`末端带有T．不能自身环化的线性质粒分开，回收线性质粒片段即为pUC57 T载体。 二．方法 1．制备pUC57质粒DNA。(见实验一) 2．用EcoR V酶解pUC57 DNA。(见实验九) 3．在酶解的pUC57 DNA末端加上T。 取一支0.5ml微离心管．加入： EcoR V酶解的pUC57 DNA 10μg 10 X PCR缓冲液 15μl dTTP 10mmol／L 20μl Taq DNA聚合酶(5U/μl) 1μl ddH2O to 150μl 10 000r/min离心5s混匀，72℃水浴2h。 4.DNA片段的纯化 (1)在上述0.5ml微离心管中加入等体积(15μl)酚／氯仿混匀，放置数分钟，5 000r/min离心5min．使液体分层。 (2)吸收酚／氯仿抽捉提之水相至另一1.5ml离心管中，加入1/10体积的乙酸钠，加2倍体积冷无水乙醇，混匀。-20℃冰箱放置2h，15 000r／min离心15min。 (3)倾去乙醇，加入70％冷乙醇淋洗。 (4)倾去乙醇，滤纸吸干，真空抽吸2～3min。 (5)加人30μl ddH2O，溶解DNA。 5．载体DNA自身连接 在DNA片段纯化管中，加入5μl 10x连接酶缓冲液和2 UT4 DNA连接酶，并用重蒸水补至总体积50μl。16℃连接16小时。 6．琼脂糖凝胶电泳 将DNA连接液在l％(Wt／V01)琼脂糖凝胶上电泳分离pUC57 T载体和原载体 7．pUC57 T载体的纯化 用琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒纯化线性载体，井用电泳对此载体进行定量。 1．10mmol／L dTTP。 2．Taq DNA聚合酶，5U/μl 3．酚／氯仿。 4. 乙醇．放置-20℃冰箱保存备用。 5．乙酸钠， 6．70％冷乙醇 7．ddH2O。 8．琼脂糖。 9．T4DNA连接酶。 10．10X连接酶缓冲液。 11．溴酚蓝指示剂 12．EB溶液 13．琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒 四．说明 本实验是一个典型的将具有平齐末端的线性DNA片段变成粘性片段的方法。在基因工程过程中．经常要将平齐末端转变为粘性末端或要将粘性末端转变为平齐末端，除了本实验中的方法外．还有下列方法： 1．在平齐末端产生新限制性内切酶位点的方法 (1)试剂 ①T4 DNA连接酶 ②10xT4 DNA连接酶反应缓冲液 300 mmol／L Tris-HCI，pH7.8 100 mmol／L MgCl2 100 mmol／L DTT 10 mmol／L ATP 注：l0X连接酶缓冲液应-20℃保存。不要多次冻存和融化。连接缓冲液中ATP降解连接反应失败的最常见原因。 ③磷酸化限制酶接头 ④无核酸酶重蒸水 ⑤限制性内切酶及其缓冲液 ⑥氯仿：异戊醇(24：1) TE缓冲液 10 mmol／L Tris—HCI l mmol／L EDTA 酚：氯仿：异戊醇(25：24：1) 混合等体积的TE缓冲液与重蒸酚，分层后，再将1份下层酚相与1份氯仿：异戊醇(24：1)混合即可。 (2)原理 限制酶接头是合成的DNA双链，含有限制性内切酶识别序列，可用于将一个新的限制 性内切酶位点加入到含平端的DNA片段上。商品化的接头有5`末端磷酸化和非磷酸化两种。磷酸化的接头更适于本实验．因为T4 DNA连接酶需要一个DNA模板5`末端含磷酸基团。使用磷酸化的接头可以与非磷酸化的载体连接，这样可以降低载体自身重新连接的背景。 (3)方法 ①取一微离心管，分别加入： 10 X T4 DNA连接酶反应缓冲液 1μl DNA(100—500ng) 1μl 磷酸化限制酶接头 超过DNA片段的摩尔数100倍· T4 DNA连接酶(Weiss单位) 2.5 u